【摘要】：二點螟Chilo infuscatellus(Snellen)屬于鱗翅目螟蛾科,是為害甘蔗的主要害蟲之一,在我國各主要蔗區(qū)為害普遍。選育抗性品種是最直接、經(jīng)濟有效的防御害蟲的方法,但是,由于甘蔗抗蟲種質(zhì)的缺乏,通過常規(guī)雜交手段難以培育出高效的抗螟蟲甘蔗品種。本文在對不同生育期的二點螟進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析的基礎上,對二點螟幾丁質(zhì)酶相關基因進行全長克隆、表達和功能分析,篩選出對二點螟生長發(fā)育具有顯著致死效果的靶標基因及其dsRNA序列,利用基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系將含有二點螟CiChi1基因dsRNA序列的RNAi植物表達載體導入甘蔗心葉組織,創(chuàng)制抗二點螟的甘蔗轉(zhuǎn)基因植株,擬為甘蔗螟害綜合治理開辟一條新的途徑。本研究取得以下幾個方面研究結(jié)果:(1)選取不同發(fā)育階段的二點螟進行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得4424800002個核苷酸,被組裝成95921個unigene基因,平均組裝長度為1542 bp,N50和N90分別為2591 bp和653 bp。對這些unigenes基因在不同數(shù)據(jù)庫中進行注釋,共有53815條unigenes可以被注釋到不同數(shù)據(jù)中,占56.1%,其中有47849、36605和19406條unigenes成功注釋于Nr數(shù)據(jù)庫、Pfam數(shù)據(jù)庫和Nt數(shù)據(jù)庫,分別占注釋unigenes總數(shù)的88.9%、68.0%和36.1%,此外,有36890條unigenes被成功注釋在55個GO條目中,占68.5%。(2)從二點螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出二點螟幾丁質(zhì)酶相關基因,并成功克隆了三個二點螟幾丁質(zhì)酶基因(CiChi1、CiChi2和CiChi11)和一個幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域1(CiChid1)片段。對這些基因進行熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)具有不同時空表達模式。CiChi1在成蟲最高表達,而在6齡前都顯著低表達;CiChi2則在6齡和成蟲高表達,5齡的表達量最低;CiChi11的表達量則是在成蟲期時低表達,3齡最高表達;CiChid1在5齡高表達,1-3齡低表達。而在不同組織部位中,CiChi11和CiChid1,是在中腸組織高表達,而在頭部和表皮組織中低表達;CiChi1和CiChi2則是在表皮組織中高表達,而在頭部和中腸組織中表達量相對較低。(3)利用RNAi技術對二點螟CiChi1基因進行功能分析,結(jié)果顯示注射二點螟CiChi1基因的dsRNA,影響了二點螟的生長發(fā)育。與對照相比,注射7天后,存活的二點螟體內(nèi)CiChi1基因表達量下降了70-80%,幼蟲的死亡率達62%。(4)將CiChi1片段的干擾序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)建到植物表達載體pUC18中,獲得pUC18-CiChi1載體,隨后,連同pTEM73載體(內(nèi)含抗草銨膦除草劑的Bar基因)質(zhì)粒利用基因槍轟擊法導入甘蔗心葉組織。以含有EGFP序列的載體為陰性對照。經(jīng)過18%草銨膦的噴施篩選和PCR轉(zhuǎn)基因檢測,共鑒定出79株轉(zhuǎn)CiChi1基因和5株轉(zhuǎn)EGFP基因的甘蔗植株。定量PCR檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)CiChi1基因植株均能表達干擾片段,但是不同轉(zhuǎn)基因植株的表達量有所差異。
【圖文】：

特異性地下調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄本的豐度。RNAi 效應的基本過程主要分為以下三步：首先，涉及到 dsRNA 被體內(nèi) RNaseⅢ家族 Dicer 酶降解成為 21-23個堿基的小干擾 RNA（siRNA）；然后，siRNA 在細胞內(nèi) RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈。繼而，由反義 siRNA 再與體內(nèi) 些如解旋、內(nèi)切等酶結(jié)合形成 RNA 誘導的沉默復合體 (RNA-induced silencing complex，RISC)；最后， RISC 與外源基因表達的 mRNA 的同源區(qū)進行特異性結(jié)合。因 RISC 表現(xiàn)出核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割 mRNA，切割位點即是與 siRNA 中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂 mRNA 隨即降解，導致翻譯受阻，最終產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象[9, 10]。其中，Argonaute 蛋白是催化 RISC 的主要組成，利用 siRNA 作為模板進行識別和降解互補的 mRNA，RNA 干擾特異性的消耗目的基因的轉(zhuǎn)錄本，達到抑制或沉默基因的表達。RNAi 具有功能性的元件可分為兩塊， 是在細胞內(nèi)的核心部件，包括 Dicer 酶，RNA 結(jié)合因子和 Argonaute 蛋白；另 部分是系統(tǒng)性的成分，其能夠增加 dsRNA 的信號傳導，，并且使其能夠快速傳遞到其他的組織中[6, 7]。RNAi 作用流程如圖 1-1 所示。

和電泳儀 美國 Bio-Rad中國 上海凌儀酶標儀 美國 BioTek實時熒光定量 PCR 系統(tǒng) 美國 ThermoA 文庫構(gòu)建和測序構(gòu)建和 Illumina 測序均由北京諾禾致源科技股份EBNext Ultra RNA 文庫制備試劑盒 (Illona ) 構(gòu)建，RNA使用總量為1.5 μg。最終產(chǎn)物經(jīng)過純化步評估文庫質(zhì)量在 Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)用 TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia) 上聚類索引編碼的樣本。生成后的集群，再將檢驗iseq 測序平臺上進行測序，并產(chǎn)生相應的配對末圖 2-1。
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.661

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本文編號：2700478