【摘要】：類受體胞質(zhì)激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)是一類無胞外信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的激酶家族。在植物中,RLCK主要通過磷酸化下游靶蛋白的方式來參與多種生理功能,包括植物生長(zhǎng)、各種植物激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答等(何含杰,2014)。BIK1(Botrytis-induced kinase 1)是一種重要的植物類受體胞質(zhì)激酶,是作用于多個(gè)免疫受體下游的樞紐蛋白,調(diào)控多條免疫防御反應(yīng)。研究表明,植物先天性免疫信號(hào)主要依靠RLK/RLCK復(fù)合物的磷酸化和轉(zhuǎn)磷酸化,而AtBIK1亦被證明可以與包括FLS2、BAK1、PEPRs等在內(nèi)的多種模式識(shí)別受體發(fā)生磷酸化,因此,研究擬南芥BIK1響應(yīng)激發(fā)植物對(duì)病原菌等的防御免疫反應(yīng)機(jī)理,對(duì)植物抗病具有重要作用。同樣地,蘋果中的BIK1是否具有與擬南芥相同的免疫作用,或者,會(huì)發(fā)生怎樣的調(diào)控機(jī)理變化,目前少有報(bào)道。因此,在本次研究中,我們分別克隆了蘋果中的兩個(gè)BIK1同源基因MdBIK1-1、MdBIK1-2,并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析,獲得了超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蘋果‘王林’愈傷。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷進(jìn)行幾種病菌的接種處理,觀察MdBIK1在蘋果中的抗病性,為接下來研究其在蛋白信號(hào)響應(yīng)以及免疫平衡調(diào)節(jié)方面的作用奠定基礎(chǔ)。本次研究的主要結(jié)果如下:1.以實(shí)驗(yàn)室已有的‘嘎啦’組培苗所獲得的cDNA為模板克隆獲得蘋果中BIK1的兩個(gè)同源基因:MdBIK1-1、MdBIK1-2。通過生物信息學(xué)分析表明,蘋果中的BIK1同樣不含胞外信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,只含有胞內(nèi)激酶域,并且BIK1屬于一種非受體雙重特異性激酶,所具有生物酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性對(duì)植物免疫信號(hào)的傳導(dǎo)具有重要意義。2.對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷進(jìn)行包括灰霉病、腐爛病兩種真菌的接菌測(cè)試,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的MdBIK1-2轉(zhuǎn)基因愈傷對(duì)灰霉病菌的擴(kuò)展表現(xiàn)出明顯的抑制作用,并且更易受到腐爛病的侵染。3.將接種灰霉病菌的普通蘋果‘王林’愈傷和MdBIK1-2的超表達(dá)愈傷送轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)接種灰霉病的轉(zhuǎn)基因愈傷對(duì)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑產(chǎn)生較為明顯的影響。4.以實(shí)驗(yàn)室已有的MdBAK1的轉(zhuǎn)基因超表達(dá)愈傷為基礎(chǔ),再次轉(zhuǎn)入MdBIK1基因,得到了MdBAK1-MdBIK1雙基因超表達(dá)愈傷,接菌發(fā)現(xiàn),MdBAK1-MdBIK1雙基因超表達(dá)愈傷使輪紋病的擴(kuò)展受到抑制,推測(cè)二者在植物先天性免疫方面可能共同發(fā)揮作用。
【圖文】：

圖 1-1 類受體胞質(zhì)激酶（RLCKs）在植物免疫和生長(zhǎng)發(fā)育方面功能的例子(Lin et al,2013)Fig.1-1 Examples of receptor-like cytoplasmic kinases (RLCKs) functions in plant immunity and development (Lin etal, 2013)1.2.2 RLCK 的生物學(xué)功能1.2.2.1 調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況因所處環(huán)境的復(fù)雜多變性，會(huì)受到各種因素如自身遺傳特性、外界環(huán)境優(yōu)劣等的影響。植物之所以能夠健康生長(zhǎng)，究其根本，主要是由于植物自身在面對(duì)不同的環(huán)境條件時(shí)能夠及時(shí)做出反應(yīng)，維持自身穩(wěn)態(tài)（Vanstraelen et al, 2012）。植物維持自身穩(wěn)態(tài)的平衡主要依靠六大激素的信號(hào)傳遞，，而類受體胞質(zhì)激酶又恰恰是植物激素信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。比如，BSK 作為 BR 信號(hào)通路的下游信號(hào)分子（Kim etal,2009; Tang et al,2008），參與植物 BR 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響植物胚軸和根的發(fā)育，已驗(yàn)證出的有擬南芥的類受體胞質(zhì)激酶 AtBSK3 基因。同樣地通過 BR 信號(hào)發(fā)揮調(diào)節(jié)植物

PK28（Liangetal;Monaghanetal,2014）。在此基礎(chǔ)上，Wang 等人發(fā)現(xiàn)了反向調(diào)節(jié)兩個(gè)同源 E3 連接酶——PUB25 和 PUB26。這兩個(gè)植物 U-box 蛋白的狀態(tài)與 BIK大小息息相關(guān)：G 蛋白抑制 PUB25/26 活性來穩(wěn)定 BIK1，而 CPK28 則通過增25/26 活性來促進(jìn) BIK1 降解。有趣的是，PUB25/26 特異性靶向未激活的 BIK1，制活化的 BIK1 庫的大小，其中 G 蛋白、PUB25/26 和 CPK28 形成信號(hào)模塊，不總量，還調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)前后激活的 BIK1 蛋白的比例，從而控制免疫穩(wěn)態(tài)（Wa,2018）。這些研究結(jié)果揭示了一個(gè)多蛋白質(zhì)調(diào)控模塊，使得免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制體和緊密。BIK1 在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。首先，BIK1 磷酸化是 BIK1 激活的前提蛋白磷酸酶 PP2C38 的負(fù)調(diào)控（Couto et al,2016）。 其次，BIK1 的穩(wěn)定性受到2 / XLG3（Gα），AGB1（Gβ）和 AGG1 / AGG2（Gγ）組成的異源三聚體 G 蛋白調(diào)控，同時(shí)也受到泛素蛋白酶體系統(tǒng)（鈣依賴蛋白酶 CPK28）的反向調(diào)控（Liang16;Monaghan et al,2014）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.611.1

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