目的:構(gòu)建含有四環(huán)素(Tetracycline,Tet)誘導(dǎo)調(diào)控降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)表達(dá)的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒,并包裝9型重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9,rAAV9),將其體外轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞,觀察重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)CGRP基因在原代心肌細(xì)胞中的表達(dá)。方法:1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒的構(gòu)建以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA為模版,PCR擴(kuò)增并插入雙酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段,再將雙酶切后的片段連接構(gòu)成重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重組腺相關(guān)病毒的包裝與鑒定將pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒與pAA-V9包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒pHelper共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA...

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１：技術(shù)線(xiàn)路圖??９??

?四環(huán)素調(diào)控ＣＧＲＰ基因表達(dá)的腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及鑒定???２．２方法??實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線(xiàn)如下圖所示：??

圖２－３?ｒＡＡＶ病毒制備流程示意圖??２．２．３．１?ＨＥＫ２９３細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)與傳代??（１）將ＨＥＫ２９３細(xì)胞從－８０°Ｃ冰箱取出，立即置于３７°Ｃ恒溫水浴箱中，迅速解??

?四環(huán)素調(diào)控ＣＧＲＰ基因表達(dá)的腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及鑒記???（２３）短暫離心，將離心管中殘余的乙醇吸出，放置于室溫下干燥數(shù)分鐘，加??１００Ｗ滅菌雙蒸水充分混勻溶解（終濃度為：ｌＵｇ／ｐＬ），存于－２０°Ｃ冰箱備用。??２．２．３?ｒＡＡＶ病毒載體的制備和檢測(cè)??

圖３－１雙酶切重組質(zhì)粒??

酶切鑒定??將?ｐＡＡＶ－ＴＲＥ－ＣＭＶ－ｔＴＳ／ｒｔＴＡ、ｐＡＡＶ－ＴＲＥ－ＣＧＲＰ－Ｍｙｃ－ｔＴＳ／ｒｔＴＡ?經(jīng)雙酶切后，??對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳（如圖３－１?），結(jié)果顯示經(jīng)雙酶切后獲取４３８ｂｐ的目??的片段。??ｂｏ??＿?１００００??＜—６０００??＜—３０００....

圖3-2TS/dTA質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

?四環(huán)素調(diào)控ＣＧＲＰ基因表達(dá)的腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及鑒定???■ｔ

本文編號(hào)：4034094