寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）是一種通過蚊蟲叮咬傳播的RNA病毒,于1947年在烏干達(dá)寨卡叢林的發(fā)熱恒河猴體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn),根據(jù)基因型差異,可分為非洲型和亞洲型。雖然ZIKV很早被發(fā)現(xiàn),但由于患者臨床癥狀輕微,僅表現(xiàn)為皮疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、結(jié)膜炎等,因此尚未引起全球關(guān)注。直至2015年巴西地區(qū)的暴發(fā)流行,并逐漸呈現(xiàn)出許多相關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重并發(fā)癥,包括新生兒小頭畸形癥、格林-巴利綜合征等,隨后世界衛(wèi)生組織將寨卡病毒感染列為全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件。因此,建立和完善寨卡病毒早期檢測和病原分型系統(tǒng)顯得尤為重要。本研究首先通過分析亞洲型寨卡病毒全基因組核酸序列特征,用AlleleID 7.2軟件設(shè)計型特異性探針和引物,建立亞洲型寨卡病毒的熒光定量PCR檢測技術(shù),構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過特異性實驗、敏感性實驗以及重復(fù)性實驗驗證該方法的有效性。隨后運用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器及多種生物信息學(xué)分析軟件,對寨卡病毒N S1蛋白B細(xì)胞表位進(jìn)行系統(tǒng)性的生物信息學(xué)分析,運用蛋白質(zhì)抗原理化性質(zhì)、跨膜區(qū)及信號肽預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)、疏水性、抗原性、靈活性、表面可及性等多參數(shù)預(yù)測,篩選B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。熒光定量PCR測試結(jié)果表明所設(shè)計的引... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－３?Ｐｒｉｍｅｉ？軟件分析探針各項參數(shù)??Ｆｉｇ．２－３?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｒｏｂｅ?ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ?ｂｙ?Ｐｒｉｍｅｒ?Ｓｏｆｔｗａｒｅ??

??圖２－６?Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件中下游引物所在位置??Ｆｉｇ．２－６?Ｌｏｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｒｅｖｅｒｓｅ?Ｐｒｉｍｅｒ?ｉｎ?Ｂｉｏｅｄｉｔ?ｓｏｆｔｗａｒｅ??ｒｍ?■丨?ｔｉ「「■■■■——ｉｎｉ?ｉｉ???ｘｊ??Ｖ?Ｋ?Ｇ

錄得到病毒的ＣＤＮＡ，以此為模板在冰上配置體系，應(yīng)用本實驗所設(shè)計的引物和??探針進(jìn)行常規(guī)ＰＣＲ反應(yīng)。所得產(chǎn)物經(jīng)２％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后顯示：目的片段??大小約為８０ｂｐ，與本實驗所設(shè)計的理論目的片段７５ｂｐ大小一致，如圖２－８。??圖２－８瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果??Ｆｉｇ．２－８?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??注：泳道１為實驗組，泳道２為陰性對照組，泳道３為ＤＬｌＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ??將目的片段連入ＰＭＤ１８－Ｔ載體中，并通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法把帶有目的片段的??質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞，于控溫?fù)u床中搖振蕩培養(yǎng)，ｌｈ后涂板。將涂有菌??液的ＬＢ平板培養(yǎng)基倒置于細(xì)菌培養(yǎng)箱３７°Ｃ培養(yǎng)１２ｈ后挑取單菌落加入裝有５??ｍＬＬＢ培養(yǎng)基的１５ｍＬ離心管中振蕩培養(yǎng)，時間１２ｈ，轉(zhuǎn)速２２００ｒ／ｍｉｎ，溫度３??７°Ｃ。�。矗恚叹禾崛≠|(zhì)粒后將所獲得質(zhì)粒ＤＮＡ送至上海生工生物工程有限??公司進(jìn)行基因測序，通過測序結(jié)果的比對確認(rèn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備成功（圖２－９和??圖２－１０）。提取到的質(zhì)粒ＤＮＡ利用分光度測定濃度為１０４．２１ｎｇ／ｐＬ，ＯＤ２６０／ＯＤ??２８０＝１．８１，說明質(zhì)粒的濃度和純度較高。根據(jù)質(zhì)粒


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