本文關(guān)鍵詞：四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:蜱傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,TBEV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)、黃熱病毒(Yellow Fever Virus,YFV)與埃博拉(Ebola Virus)病毒均是高致病性烈性病毒,對(duì)于這些病毒的實(shí)驗(yàn)研究需要在高等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,增加了實(shí)驗(yàn)的成本和難度。為了能夠降低實(shí)驗(yàn)感染風(fēng)險(xiǎn),能在低等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室完成相關(guān)病毒的檢測(cè)與鑒定,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)4種高致病性病毒的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),分別選取了適合用作診斷抗原的基因,用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原,為這4種高致病性烈性病毒的血清學(xué)特異性診斷提供了候選抗原。方法:1.將TBEV的pr M-E基因連接到p NLF1-sec N質(zhì)粒中構(gòu)建真核表達(dá)載體p NLF-pr M-E,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中,與Nano Glo Luciferase熒光素酶蛋白進(jìn)行融合表達(dá),并通過測(cè)定細(xì)胞上清液的熒光素酶值鑒定蛋白的表達(dá)情況;間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定重組蛋白與TBEV特異性抗體的結(jié)合情況;熒光素酶免疫共沉淀(Luciferase Immunoprecipitation System,LIPS)方法對(duì)20份TBEV病人陽性血清及3份正常人血清進(jìn)行檢測(cè)。2.通過原核表達(dá)的方法將CHIKV的E1、E2基因,YFV的E基因和Ebola V的NP基因重組表達(dá),并通過鎳柱親和純化重組蛋白;將CHIKV的重組蛋白作為檢測(cè)抗原,通過ELISA方法對(duì)基孔恢復(fù)期病人感染血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè);以YFV的重組蛋白作為檢測(cè)抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)室已制備的YFV免疫鼠血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè);將Ebola V的重組蛋白NP作為免疫原免疫小鼠,并以NP蛋白作為檢測(cè)抗原對(duì)免疫小鼠血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p NLF-pr M-E的細(xì)胞上清中可檢測(cè)到熒光素酶的高表達(dá);間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)到用p NLF-pr M-E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與TBEV抗體特異結(jié)合;LIPS方法以重組蛋白pr M-E為檢測(cè)抗原從20份TBEV患者血清中檢測(cè)出19份陽性結(jié)果,3份正常人血清均為陰性。2.成功表達(dá)并純化出CHIKV的CHIKV E1-1、CHIKVE2-1與CHIKV E2-2重組蛋白,YFV的YFV E1-1、YFV E1-2與YFV E2-1重組蛋白,以及Ebalo V的NP重組蛋白;未能成功表達(dá)CHIKV E1-2與YFV E2-2重組蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1與CHIKV E2-2三種重組抗原作均能與基孔恢復(fù)期病人感染血清特異性結(jié)合,并與同屬病毒免疫的對(duì)照血清無交叉反應(yīng);YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-1三種重組抗原均能與YF免疫鼠血清中的抗體良好結(jié)合,雖與DEN3型患者血清有一定的交叉反應(yīng),但與陽性鼠血清相比可以辨別區(qū)分;成功制備了Ebola V免疫小鼠血清,血清中的抗體能與重組抗原NP特異結(jié)合,并與其它對(duì)照血清無交叉反應(yīng)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體p NLF-pr M-E,并在COS7細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)pr M-E蛋白具有良好的抗原性,可作為TBEV感染的檢測(cè)抗原。2成功構(gòu)建了CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YF E2-2與NP的重組表達(dá)質(zhì)粒,均能在原核細(xì)胞中正確誘導(dǎo)表達(dá)蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-2與NP重組抗原均有良好的抗原性,有望作為CHIKV、YFV和Ebola V檢測(cè)的候選診斷抗原。
【關(guān)鍵詞】：烈性病毒 抗原 診斷 真核表達(dá) 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-17
• 1 病毒簡(jiǎn)介10-12
• 2 病毒感染的診斷方法12-14
• 3 抗原表達(dá)系統(tǒng)的類型14-16
• 5 研究?jī)?nèi)容與意義16-17
• 第一部分 蜱傳腦炎病毒Pr M-E抗原在真核系統(tǒng)中的表達(dá)及鑒定17-33
• 引言17-18
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒及血清18
• 1.2 試劑與耗材18-19
• 1.3 常規(guī)溶液配制19-20
• 1.4 主要儀器20
• 2 方法20-28
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建20-26
• 2.2 真核蛋白的表達(dá)26-27
• 2.3 真核蛋白的鑒定27-28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-31
• 4 討論31-32
• 5 結(jié)論32-33
• 第二部分 三種高致病性病毒重組抗原的原核表達(dá)及鑒定33-62
• 1 引言33-35
• 2 材料35-38
• 2.1 病毒及血清35
• 2.2 試劑與耗材35-36
• 2.3 常規(guī)溶液配制36-38
• 2.4 主要儀器38
• 3 方法38-50
• 3.1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建38-47
• 3.2 構(gòu)建原核表達(dá)菌株47
• 3.3 重組蛋白的表達(dá)47-48
• 3.4 融合蛋白的純化48
• 3.5 埃博拉病毒抗 NP 蛋白鼠血清的制備48-49
• 3.6 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)49
• 3.7 ELISA抗原結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)49-50
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-58
• 5 實(shí)驗(yàn)討論58-61
• 6 結(jié)論61-62
• 綜述62-66
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷73-74
• 致謝74

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1 王均珠　實(shí)習(xí)生 常青;查出烈性病毒 只需一天[N];貴陽日?qǐng)?bào);2007年

2 記者　 陳勇 通訊員　 蔣明 楚靜 實(shí)習(xí)生 王玨;楊占秋扼住烈性病毒咽喉[N];湖北日?qǐng)?bào);2006年

3 陳健雄;警惕豬亞健康綜合征[N];河北科技報(bào);2007年

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1 冉鑫;四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：317524