背景及目的:基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)、黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是常見的六種蟲媒病毒,主要通過蚊蟲叮咬的方式在人群中廣泛傳播,它們在全球分布廣泛,感染人數(shù)眾多,帶來嚴重的疾病負擔。它們在感染人體后,會引起發(fā)熱、皮疹、乏力等類似的臨床表現(xiàn),給臨床醫(yī)生進行疾病的早期鑒別診斷帶來一定困難。此外,共感染病例的出現(xiàn),給臨床診斷和治療帶來巨大挑戰(zhàn),極易導(dǎo)致漏診、誤診。目前,常用的檢測方法,由于受到各種因素的影響,不能完全滿足臨床的需求。因此開發(fā)一種新的鑒別診斷方法,對該類疾病的診斷、治療、預(yù)防與控制具有重要意義。近年發(fā)展起來的實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR),它具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好等特點,受到人們廣泛關(guān)注。本研究基于實時熒光定量PCR技術(shù),探索建立一種能同時檢測上述六種蟲媒病毒的方法,提高檢測效率,為臨床診斷提供一種新的快速檢測方法。方法:從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載CHIKV、DENV、WNV、JEV、ZIKV和YFV基因序列,用MEGA7.0軟件進行序列比對分析。針對CHIKV-E3、DENV3'-UTR、WNV-NS2A、YFV5'-UTR、JEV5'-UTR、ZIKV-E基因的保守區(qū)域設(shè)計引物和探針。利用標準品質(zhì)粒和病毒RNA模板進行多重實時熒光定量PCR檢驗,建立標準曲線,并評價各體系的特異性、靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果:設(shè)計的引物探針相互之間沒有交叉非特異性擴增。檢測CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的檢測下限為5拷貝/反應(yīng)和10-3～10-1TCID50/反應(yīng)之間。循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)與起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)和病毒滴度的對數(shù)的相關(guān)系數(shù)都在0.99以上。用不同稀釋梯度的標準品質(zhì)粒分別進行重復(fù)性檢測,每個稀釋度中Ct值的變異系數(shù)均小于4%。對收集到的31份疑似感染蟲媒病毒的臨床樣本用新建立的方法進行檢測發(fā)現(xiàn),樣本陽性率為87.1%(27/31),與商品化試劑盒的檢測結(jié)果一致,符合率為100%。這些樣本中沒有共感染病例的出現(xiàn)。用這種方法去檢測樣本,最快可在2小時內(nèi)完成。結(jié)論:我們成功地建立了一種能同時檢測CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的實時熒光定量PCR方法,并具有特異性好、靈敏性高、穩(wěn)定性強、快速、簡便等優(yōu)點。該方法可以用于臨床樣本檢測,有一定的實用價值。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

體系引物特異性驗證結(jié)果

圖 2.多重?zé)晒舛?PCR 檢測方法靈敏度驗證（標準品質(zhì)粒）我們將測定好的 TCID50 的不同病毒統(tǒng)一稀釋到 2×104TCID50/ml，然后提取病毒 RNA，再進行 10 倍比等比稀釋。利用稀釋好的病毒 RNA 對我們建立的多重 qPCR 方法進行靈敏度檢測。圖 3 展示的是該方法對 CHIKV-RNA、YFV-RNA、JEV-RNA、ZIKV-RNA 的檢測結(jié)果，我們可以看到各自典型的擴增曲線，且不同稀釋度的病毒滴度的對數(shù)與 Ct 值之間存在良好的線性關(guān)系，其R2值都在 0.99 以上。我們得到了各自的標準曲線曲線方程，往后，我們通過實驗檢測樣本的 Ct 值，代入到方程中，就能估算樣本的病毒滴度。通過該實驗我們可以發(fā)現(xiàn)：針對 CHIKV 的檢測下限為 10-2TCID50/反應(yīng)；針對 YFV-BJ01和 YFV-SH01 的檢測下限都為 10-2TCID50/反應(yīng)；針對 JEV 的檢測下限為 10-

30圖 3.多重?zé)晒舛?PCR 檢測方法靈敏度驗證（病毒 RNA）3.4 重復(fù)性檢測對濃度為 106～100拷貝數(shù)/μl 的 CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV、ZIKV 基因重組質(zhì)粒，分別進行檢測，重復(fù) 3 次，根據(jù) Ct 值計算平均數(shù)、標準差及變異系
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本文編號：2874426