一、研究背景由于燃料廢氣的排放,吸煙及工作環(huán)境等原因,各種有害致癌物質會嚴重改變正常肺組織生存的微環(huán)境,導致炎癥疾病外,甚至引起肺部腫瘤的發(fā)生。據統(tǒng)計,2013年中國的癌癥患者中,肺癌患者人數在男性中處于首位,在女性患者中僅次于乳腺癌。此外,因癌癥而死亡的患者中,肺癌患者占到了第一位。肺癌的治療主要包括手術、化療、放療及靶向治療有四種方式。然而,每一種治療手段都是一把雙刃劍,既有其獨特的優(yōu)勢,也有不可忽視的缺點。其中,放療在肺癌的早期及晚期治療中有著重要的作用,但是放療在通過射線殺死腫瘤的同時,不可避免的對放射野內正常肺組織產生不必要的損傷,導致放射性肺炎的產生,嚴重影響患者的預后情況。其次,由于部分腫瘤細胞本身對輻射的抵抗性,增加臨床放療劑量的同時,又會加重對正常肺組織的損傷。目前,針對臨床放射性肺炎的治療主要是通過給予糖皮質激素緩解病人癥狀,而長時間使用激素會對人體帶來嚴重的副作用。因此,我們研究的目的是為了找出一種在放療中既能保護正常肺組織又能增強腫瘤治療的藥物。原花青素是目前已知的抗氧化能力最強的天然提取物,遠高于日常使用的維生素C及維生素E。其具有來源廣泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的優(yōu)勢。此外,原花青素的生物體內的半數致死劑量超過5000mg/kg,遠遠大于治療劑量。原花青素對肺組織相關炎癥及疾病具有較好的治療作用:原花青素可以有效減輕角夾膠誘導的肺組織急性炎癥反應,減輕小鼠哮喘模型的急性氣道炎癥反應,抑制肺水腫的形成,且對博來霉素誘導的肺炎具有很好的治療作用。本實驗室前期研究成果發(fā)現,原花青素可以顯著減輕輻照后早期放射性肺炎的炎癥滲出和晚期放射性肺纖維化的發(fā)生,降低輻射所導致的肺組織上皮間質轉化程度,減輕炎癥因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改變程度。另外,與其他抗氧化劑不同的是,原花青素是一種緩釋抗氧化劑,他可以在血液和組織中存留7-10天,發(fā)揮持續(xù)的抗氧化作用,這對于病情進行性進展的放射性肺損傷的防治具有獨到的優(yōu)勢。此外,原花青素還具有抗腫瘤作用。過去的十年體外細胞實驗和動物實驗均已經證明原花青素對皮膚癌,乳腺癌,前列腺癌,頭頸部腫瘤和肺癌等腫瘤細胞增殖具有明確抑制作用。研究者還在體外實驗中證實原花青素對正常細胞的生長和活力沒有明顯影響,而只對腫瘤細胞表現出殺傷作用。綜合以上的特點,我們推測,原花青素有希望在肺癌放療過程中,防護放射野內正常的肺組織的同時,對肺癌細胞又起到抑制增殖的作用。本課題將重點研究原花青素在肺癌放療中的雙向作用及其分子機制。二、研究內容(一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。通過原位肺內注射法建立原位肺癌模型。特點:以左肺上葉作為肺癌細胞的生長環(huán)境,通過基質膠固定細胞位置。(二)原花青素在肺癌放療中的雙向作用。1、原花青素在細胞作用中的研究。(1)通過CCK8檢測原花青素在小鼠正常肺上皮細胞MLE-12及人正常肺上皮細胞BEAS-2B中的毒性;(2)通過流式檢測及克隆形成率實驗檢測原花青素對肺正常細胞的輻射防護作用及對肺腫瘤細胞的輻射增敏作用。2、原花青素在肺癌模型中的作用。(1)原花青素能夠抑制小鼠腫瘤的生長及轉移(1)原花青素抑制小鼠皮下腫瘤的生長;(2)原花青素抑制小鼠腫瘤的轉移。(2)原花青素影響荷瘤小鼠局照后的生存狀況;(3)原花青素對荷瘤小鼠局照后腫瘤大小及肺葉重量的影響;(4)原花青素減少荷瘤小鼠局照后正常肺組織的炎性滲出;(5)原花青素能夠減少小鼠肺正常組織照射后的凋亡,而促進照射后腫瘤組織的凋亡,同時抑制其增值;(6)原花青素能夠調節(jié)Th1/Th2相關細胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。(三)原花青素在肺癌放療中雙向作用的機制研究。1、原花青素可以明顯降低輻照后A549及BEAS-2B細胞中活性氧的產生;2、原花青素對肺正常細胞及腫瘤細胞內的p-ERK、p-JNK及p-P38表達情況的影響具有差異;3、原花青素可以激活肺正常細胞及腫瘤細胞Sirt6蛋白的表達;4、研究肺正常細胞及腫瘤細胞過表達Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表達情況;5、通過抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達,觀察Sirt6的表達情況,判斷Sirt6蛋白在原花青素中的作用。三、研究方法(一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。1、用胰島素注射器將腫瘤細胞與基質膠的混懸液注射入小鼠左上肺葉,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;2、使用本實驗室設計的固定小鼠模具,采取鉛塊遮擋的方式建立肺部局照放射模型;3、照射方式:采用25Gy~(60)Coγ射線單次照射,劑量率為1Gy/min。(二)研究原花青素在肺癌放療中的雙向作用1、選取小鼠肺上皮細胞MLE-12、肺癌細胞LLC及人正常肺上皮細胞BEAS-2B、肺腺癌細胞A549進行試驗;(1)細胞分組:對照組、原花青素處理組、照射組、照射組加原花青素處理組,每種細胞分組相同,照射劑量為8Gy;(2)細胞照射及原花青素處理后對正常細胞及腫瘤細胞增殖能力的影響:流式細胞儀檢測及克隆形成率;2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基礎上檢測原花青素的雙向作用(1)小鼠分為:假手術對照組、假手術肺部照射組、肺部荷瘤對照組、肺部荷瘤原花青素處理組、肺部荷瘤照射組及肺部荷瘤原花青素加照射組,共6組,每組選用雄性8周C57BL/6小鼠3只;(2)原花青素及照射對原位荷瘤小鼠的生存影響:檢測荷瘤小鼠生存期及體重;(3)原花青素及照射對原位荷瘤小鼠腫瘤的影響:檢測腫瘤大小,HE染色及小鼠左上肺葉重量;(4)免疫熒光檢測正常肺組織及腫瘤組織的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;(5)檢測原花青素對小鼠免疫細胞因子的影響:用ELISA方法檢測小鼠血清細胞因子IL-6和IFN-γ。(三)原花青素在肺癌放療中雙向作用的分子機制1、檢測原花青素對照射后細胞內活性氧的清除:ROS檢測試劑盒;2、檢測原花青素對照射后細胞內相關蛋白變化的影響:Western blot;3、檢測原花青素對照射后原位荷瘤小鼠正常肺組織及腫瘤組織蛋白的影響:Western blot;4、通過改變細胞內Sirt6的表達檢測p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達:Sirt6過表達質粒的轉染、Western blot;5、通過選取抑制劑S1805、SP600125及SB203580分別抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達,觀察Sirt6的表達情況:Western blot。四、實驗結果(一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型1、成功建立小鼠左上肺葉原位肺癌荷瘤模型,腫瘤生長符合實驗要求;2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。(二)原花青素在肺正常細胞及腫瘤細胞放療中的雙向作用1、對小鼠肺正常及腫瘤細胞的雙向研究:通過流式細胞儀檢測,發(fā)現原花青素能夠減少小鼠肺上皮細胞MLE-12照射后的凋亡;通過克隆形成率實驗,原花青素對小鼠肺上皮細胞MLE-12具有輻射防護作用,對小鼠肺癌細胞LLC具有輻射增敏作用;2、對人肺正常及腫瘤細胞的雙向研究:通過流式細胞儀檢測,發(fā)現原花青素能夠減少人正常肺上皮細胞BEAS-2B凋亡且促進人肺腺癌細胞A549的凋亡;通過克隆形成率實驗,原花青素對人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞具有輻射防護作用,且能夠抑制人肺腺癌細胞A549的生長,具有輻射增敏作用;(三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放療中的雙向作用研究1、通過觀察并記錄原位肺癌荷瘤小鼠的生存情況,發(fā)現:原花青素處理加照射組相比于照射組,其存活時間更長;2、通過對小鼠肺內腫瘤的測量,發(fā)現:原花青素處理加照射抑制小鼠左上肺葉內腫瘤的生長,相比較于單純照射組,效果更加明顯;3、通過熒光免疫分別標記增殖相關蛋白Ki67及凋亡相關蛋白p53,發(fā)現:在小鼠正常肺組織內,原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達量明顯降低;在腫瘤組織內,單純處理組的Ki67的表達量相比于對照組明顯降低,而原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達量明顯升高;4、通過ELISA檢測荷瘤小鼠血清細胞因子的表達量,發(fā)現:原花青素加照射組相比于單純照射組,能夠明顯抑制IL-6、提高IFN-γ的表達,促進對腫瘤的抑制,降低炎性損傷。(四)原花青素在肺癌放療中的可能作用機制1、原花青素能夠顯著清除人肺癌細胞A549及正常肺上皮細胞BEAS-2B照射后所產生的自由基;2、在人肺癌細胞A549中,原花青素明顯提高照射后p-JNK蛋白的表達;在人正常肺上皮細胞BEAS-2B中,原花青素可以明顯抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而這與其能夠清除活性氧自由基有關。3、在人肺癌細胞A549中,原花青素通過增加Sirt6蛋白的表達進而改變p-JNK、p-P38蛋白的變化,促進輻射增敏作用五、結論在細胞層面上我們發(fā)現,原花青素對小鼠肺癌細胞LLC及人肺癌細胞A549具有輻射增敏作用,對小鼠肺正常細胞MLE-12及人正常肺上皮細胞BEAS-2B具有輻射防護作用。在人肺癌細胞A549中,原花青素可以通過提高Sirt6蛋白的表達進而改變p-JNK、p-P38蛋白的變化,促進輻射增敏作用。在人正常肺上皮細胞BEAS-2B中,原花青素可能通過清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎癥作用。通過建立小鼠原位肺癌的放療模型,我們發(fā)現原花青素能提高小鼠的生存期,可以改變血清細胞因子的表達,能夠減少小鼠肺正常組織的輻射損傷,同時對腫瘤具有放療增敏的作用。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2;R730.55
【部分圖文】：

小鼠荷瘤部位

荷瘤用胰島素注射器

以正常進食進水。分別于荷瘤后第 7、10、14、21 及 30 天處死小鼠，取荷葉觀察大體（圖 1.3）。可觀察到：小鼠左肺上葉所荷腫瘤隨著時間逐漸增大0 天左右，荷瘤小鼠大部分死亡，解剖胸腔可見大量腫瘤胸腔轉移。以荷瘤肺最大橫截面積位置做石蠟切片并 H&E 染色（圖 1.3）。其中，深染部為腫瘤為正常腫瘤組織。
【參考文獻】

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