【摘要】：背景杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是常見致死性X連鎖隱性遺傳病。臨床上DMD尚無(wú)有效治療手段,主要是通過(guò)物理治療、糖皮質(zhì)激素治療、矯形治療等,但都不能延長(zhǎng)患者壽命。DMD基因治療是目前治療DMD最有希望的手段之一。DMD基因治療依賴于高效的病毒載體系統(tǒng),其中腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)、腺病毒(adenovirus,AdV)、慢病毒(lentivirus,LV)等在DMD的基因治療研究中廣泛應(yīng)用。然而,目前國(guó)內(nèi)的病毒包裝技術(shù)不成熟,病毒滴度不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,同時(shí)包裝成本高,價(jià)格昂貴。因此,建立高效且經(jīng)濟(jì)的病毒包裝平臺(tái)能更好的促進(jìn)DMD基因治療研究在臨床中的應(yīng)用。目前DMD的基因治療研究多采用患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。然而iPSCs獲取效率低,無(wú)法避免轉(zhuǎn)染病毒帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid,AFMSC)是羊水干細(xì)胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSCs)的一種,其來(lái)自產(chǎn)前診斷標(biāo)本,避免了倫理限制,沒有致瘤性,為DMD基因治療的研究提供新的干細(xì)胞來(lái)源。因此,本研究在體外建立AAV6,AdV5和LV病毒的包裝體系。同時(shí)收集1例DMD患胎來(lái)源的羊水,從羊水中分離出AFMSC并完成鑒定。將包裝好的AAV6,AdV5和LV病毒感染AFMSC,觀察三種病毒感染AFMSC的效率,以期建立高效且經(jīng)濟(jì)的病毒包裝平臺(tái),為后續(xù)DMD發(fā)病機(jī)制和基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的1.建立AAV6,AdV5和LV病毒的包裝體系。2.完成DMD患胎來(lái)源的AFMSC的分離與鑒定3.觀察三種病毒感染AFMSC的效率。方法1.體外進(jìn)行AdV5、AAV6和LV病毒的包裝,并利用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)完成病毒滴度的測(cè)定。2.收集1例DMD基因第10-15外顯子發(fā)生缺失的DMD患胎來(lái)源的人羊水樣本,利用直接貼壁法分離出AFMSC,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、染色體核型分析和流式細(xì)胞術(shù)(CD34、CD45、CD73、CD105)對(duì)AFMSC進(jìn)行鑒定。3.將三種病毒感染AFMSC,比較感染的效率,評(píng)估包裝后病毒的感染能力。結(jié)果1.成功完成三種病毒的體外包裝。在三種病毒中,AAV6病毒、AdV5病毒和LV病毒的滴度分別為1.890×10~(13)vg/mL、1.280×10~8 vg/mL和1.252×10~(11)vg/mL。2.從DMD患胎來(lái)源的羊水樣本中成功分離出AFMSC。AFMSC呈梭形或長(zhǎng)梭形,單層生長(zhǎng),旋渦樣排列。染色體核型分析表明AFMSC為正常核型。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明AFMSC表面標(biāo)志物CD34和CD45為陰性,CD73和CD105為陽(yáng)性。3.三種病毒均成功感染AFMSC。在感染效率上,AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)在體外完成AdV5、AAV6和LV病毒的包裝。同時(shí)也從DMD患胎來(lái)源的羊水樣本中成功分離出AFMSC并完成鑒定。體外包裝的三種病毒均能成功感染AFMSC,其中AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R746.4;R450
【圖文】：

圖 2 AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞 24h、48h 和 72h 的情況（100×）A：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞 24h 的細(xì)胞形態(tài)圖；B ：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞 48h 的細(xì)胞形態(tài)圖；C：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞 72h 的細(xì)胞形態(tài)圖；D：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞24h 的熒光圖；E：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞 48h 的熒光圖；F：AAV6 病毒轉(zhuǎn)染 HEK-29細(xì)胞 72h 的熒光圖。

羊水標(biāo)本DMD基因MLPA檢測(cè)結(jié)果

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 嚴(yán)冰浩;張燕;方碩;王越;劉厚奇;;間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的制備方法及應(yīng)用[J];解剖學(xué)雜志;2016年05期

2 鐘玉蘭;淦鑫;;間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體在肺部疾病中的應(yīng)用與作用[J];中國(guó)組織工程研究;2019年13期

3 阿諾得 卡普蘭;廖聯(lián)明;王萍;譚建明;;間充質(zhì)干細(xì)胞更改名稱的時(shí)候到了[J];中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版);2017年05期

4 邱坤銀;廖雄宇;郭淑儀;祁皓寧;藍(lán)菁菁;方建培;黃科;黎陽(yáng);徐宏貴;周敦華;;間充質(zhì)干細(xì)胞治療兒童難治性遲發(fā)性出血性膀胱炎療效和安全性的臨床研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2018年03期

5 陳俊秋;黃梁滸;;間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體促血管再生的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2018年06期

6 賴秀藍(lán);馬廉;;間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化前景[J];中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志;2016年06期

7 申曉靖;劉海蓉;劉新燕;趙鵬;鄭建金;盧恕來(lái);王超;;阿司匹林影響人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的新型藥理研究[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

8 陶一昕;馬鋼;;皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2017年04期

9 湯沈力;譚秋雯;周宇婷;呂青;;脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2017年06期

10 徐麗;唐葉丹;丁迎春;;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療移植物抗宿主病患者的護(hù)理[J];護(hù)理學(xué)雜志;2017年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 白雪;霍波;;面積約束情況下形狀對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響[A];第十一屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

2 李坦;劉卓;徐運(yùn);;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（上）[C];2015年

3 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

4 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

5 張彥;李尚珠;;間充質(zhì)干細(xì)胞在血管工程中的機(jī)制及應(yīng)用[A];2009全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合周圍血管疾病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2009年

6 石玉;戴\戎;;周期性拉應(yīng)力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化影響的研究[A];第九屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

7 黎嬌;朱爭(zhēng)艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對(duì)肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第30次學(xué)術(shù)年會(huì)暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 余慧;黃紅云;陳琳;王洪美;;生物反應(yīng)器培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第六屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2011年

9 覃永亮;曾慧蘭;卜欠欠;鐘啟;韓新愛;;尼古丁誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[A];第13屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2011年

10 喬淑敏;陳廣華;王易;吳德沛;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（下冊(cè)）[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 見習(xí)記者 卜葉;科學(xué)家勾勒間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用“路線圖”[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

2 本報(bào)記者 劉艷芳;牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞填補(bǔ)了干細(xì)胞研究的空白[N];廣東科技報(bào);2017年

3 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;間充質(zhì)干細(xì)胞：干細(xì)胞中的孫悟空[N];上海科技報(bào);2014年

4 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質(zhì)干細(xì)胞研究又見新方法[N];健康報(bào);2013年

5 劉道安;細(xì)胞產(chǎn)品國(guó)家工程研究中心啟用間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)[N];健康報(bào);2007年

6 記者　陳建強(qiáng);首家間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)在津建成[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

7 南方日?qǐng)?bào)記者 嚴(yán)慧芳;選擇干細(xì)胞儲(chǔ)存須謹(jǐn)慎[N];南方日?qǐng)?bào);2016年

8 記者 李素鋒;我市首例間充質(zhì)干細(xì)胞移植手術(shù)取得成功[N];臨汾日?qǐng)?bào);2009年

9 馮國(guó)梧;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)規(guī)�；\(yùn)營(yíng)[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

10 劉瑩清;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)泰達(dá)規(guī)模運(yùn)營(yíng)[N];北方經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬彩云;間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞修復(fù)肺損傷研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

2 浦雯雯;人小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞體外快速成肝誘導(dǎo)相關(guān)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

3 韓兵;脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子抗病理性瘢痕成纖維細(xì)胞纖維化的作用及分子機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

4 亓立峰;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及細(xì)胞因子共移植治療腦損傷的分子機(jī)理研究[D];山東大學(xué);2018年

5 鄧鑫;PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離鑒定的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

6 朱永朝;人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞特性及其生物學(xué)功能的研究[D];寧夏大學(xué);2015年

7 段妍;細(xì)胞膜片技術(shù)的成骨微環(huán)境的研究及新型成骨材料的研發(fā)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

8 易東曄;膠質(zhì)瘤相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中向血管周細(xì)胞分化及其血管生成能力的研究[D];華中科技大學(xué);2018年

9 張穎穎;脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臭氧誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病小鼠作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

10 蔣莉;切除大網(wǎng)膜脂肪對(duì)人體血壓的影響及不同能量超聲干預(yù)對(duì)于人網(wǎng)膜脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞影響的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張飛宇;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 楊星晨;納米復(fù)合纖維膜誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

3 郭依琳;三種包裝病毒對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良羊水間充質(zhì)干細(xì)胞感染效率的觀察研究[D];鄭州大學(xué);2019年

4 黃奎;MSCs源性外泌體促周圍神經(jīng)再生作用及機(jī)制的初步研究[D];海南醫(yī)學(xué)院;2018年

5 陸夢(mèng)婷;Pax2通過(guò)Runx2促進(jìn)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及成骨向分化[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

6 林瑤;間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外衰老的初步研究[D];深圳大學(xué);2018年

7 張霞;基于合成基因回路的尿酸調(diào)控評(píng)價(jià)研究[D];安徽大學(xué);2019年

8 魏真真;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的影響及相關(guān)作用機(jī)制探討[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

9 楊作峰;人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)妊娠期糖尿病大鼠血糖及胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響的研究[D];沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院;2019年

10 楊悅;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)乳腺癌的殺傷效應(yīng)及凋亡研究[D];天津大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2730377