【摘要】：阿爾茨海默病(alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,具有強(qiáng)烈的遺傳傾向。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因組中單個(gè)核苷酸的變化引起的遺傳物質(zhì)(DNA)序列的多態(tài)性,人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等都與SNP有關(guān)。本課題的目的是篩選一種穩(wěn)定可靠地等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),通過(guò)檢測(cè)與AD相關(guān)基因SNP位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)阿爾海默癥基因診斷試劑盒,從而對(duì)該疾病進(jìn)行早期的診斷和預(yù)防。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們初步篩選出65個(gè)與AD相關(guān)的SNP位點(diǎn),并重點(diǎn)探索了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的三種改進(jìn)方法:1.智能等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Smart amplificaton prcoess,SMAP)利用非對(duì)稱(chēng)性引物設(shè)計(jì)和加入TaqMuts錯(cuò)配修復(fù)蛋白來(lái)抑制非特異性擴(kuò)增,減少假陽(yáng)性現(xiàn)象的發(fā)生。文中首先提取了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U87)的基因組DNA,設(shè)計(jì)了鑒定基因ALDH2 rs671的引物組來(lái)驗(yàn)證了SMAP方法的可行性,對(duì)比發(fā)現(xiàn)分型結(jié)果與一代測(cè)序結(jié)果一致,而且數(shù)據(jù)顯示TaqMuts錯(cuò)配修復(fù)蛋白具有明顯減少非特異擴(kuò)增的作用,只需15 min就可以觀察到分型結(jié)果,40 min可以完成整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程。但是隨后基因APOE rs429358的分型實(shí)驗(yàn)卻并未成功。2.基于連接反應(yīng)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Ligation-Loop-Mediated Isothermal Amplification,L-LAMP)通過(guò)設(shè)計(jì)兩條與目標(biāo)序列互補(bǔ)的發(fā)夾探針,在Taq DNA連接酶的作用下兩條探針可以形成啞鈴狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)正好可以作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的中間產(chǎn)物啟動(dòng)LAMP反應(yīng)。文中我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)rs429358位點(diǎn)兩條發(fā)夾探針進(jìn)行檢測(cè),但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不穩(wěn)定。經(jīng)分析,實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能出現(xiàn)了發(fā)夾探針錯(cuò)配或形成二聚體等現(xiàn)象導(dǎo)致連接反應(yīng)失敗或效率降低,從而影響LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。3.改進(jìn)的LAMP(Modified-Loop-Mediated Isothermal Amplification,M-LAMP)該方法引物設(shè)計(jì)明顯簡(jiǎn)單,對(duì)SNP的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度也顯著提高。文中我們?cè)O(shè)計(jì)了檢測(cè)基因PICALM rs3851179和基因APOE rs429358的兩組引物,數(shù)據(jù)顯示擴(kuò)增結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。其中引物FIP和BIP除與靶序列互補(bǔ)的部分外5’端連接一段互補(bǔ)的回文序列,該互補(bǔ)的回文序列可以根據(jù)實(shí)際要求設(shè)計(jì)成通用序列,3’端是待測(cè)的SNP位點(diǎn)。與傳統(tǒng)LAMP的產(chǎn)物積累方式不同,由于引物FIP和BIP的5’端特殊結(jié)構(gòu),形成的產(chǎn)物可以相互充當(dāng)引物,進(jìn)行下一輪擴(kuò)增。這樣擴(kuò)增產(chǎn)物相互串聯(lián),最終形成大量靶序列的串聯(lián)重復(fù)序列產(chǎn)物。結(jié)論:SMAP方法、L-LAMP方法在SNP檢測(cè)方面存在一定局限,無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模地推廣應(yīng)用。相反,M-LAMP方法具有較高的特異性和穩(wěn)定性,在引物設(shè)計(jì)、長(zhǎng)片段的擴(kuò)增、SNP檢測(cè)方面都有明顯的優(yōu)勢(shì)。M-LAMP方法作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)或SNP檢測(cè)技術(shù),具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)基因APP主要編碼β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP），PSEN1和PSEN2分別編碼早

指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的原理示意圖一：（A）NASBA擴(kuò)增方案
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16;R440

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 洪穎;段勇;徐秋月;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究與應(yīng)用[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師;2018年05期

2 李森;王源升;余紅偉;李瑜;;多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2017年02期

3 高瑤;孟星宇;羅玉子;胡永浩;仇華吉;;等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及其在病原檢測(cè)中的應(yīng)用[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年08期

4 朱智壕;葛麗雅;涂曉波;余超挺;黃欣迪;卞學(xué)海;亓雙;張恒;;等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2015年12期

5 楊柳;張一;邊忠博;陳宇飛;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在農(nóng)村食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用分析[J];中國(guó)農(nóng)村衛(wèi)生事業(yè)管理;2016年02期

6 王德國(guó);王永真;王愛(ài)萍;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的假陽(yáng)性擴(kuò)增研究[J];許昌學(xué)院學(xué)報(bào);2015年05期

7 吳家林;沙丹;孫燕萍;馬廣源;張敬平;凌霞;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)志賀菌[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2014年09期

8 張吉紅;余澍瓊;徐瑛;張慧麗;陳先鋒;陳劍平;陳炯;;逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)草莓潛隱環(huán)斑病毒的研究[J];植物保護(hù);2013年06期

9 湯潛;劉曉斐;胡成進(jìn);;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年07期

10 吳家林;沙丹;孫燕萍;馬廣源;張敬平;凌霞;;應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)副溶血性弧菌[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2013年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 鄒杰;吳文學(xué);索勛;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)弓形蟲(chóng)方法的建立[A];首屆中國(guó)獸藥大會(huì)——獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集（2008）[C];2008年

2 呂志慧;馬全英;祝秀梅;王凡;劉學(xué)榮;黃銀君;牟克斌;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)中國(guó)微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)（第三屆中國(guó)獸藥大會(huì)學(xué)術(shù)論壇）論文集[C];2010年

3 許會(huì)會(huì);雷連成;;志賀氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)中國(guó)微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)（第三屆中國(guó)獸藥大會(huì)學(xué)術(shù)論壇）論文集[C];2010年

4 任春陽(yáng);田甜;田杰;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在臨床上的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

5 楊勁;王娟;吳南屏;孟忠華;呂杭軍;徐岱;;一種改進(jìn)型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)[A];2012年浙江省醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨革蘭陰性菌感染論壇論文集[C];2012年

6 楊勁;王娟;吳南屏;孟忠華;呂杭軍;徐岱;;一種改進(jìn)型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)[A];2012年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)肝病、感染病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨浙江省感染科醫(yī)師學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

7 鄭念廣;曾小娜;羅滿林;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

8 陳紅遠(yuǎn);王麗;鐘青萍;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)志賀氏菌[A];2010第二屆中國(guó)食品安全高峰論壇論文集[C];2010年

9 王中光;張守發(fā);曹世諾;賈立軍;薛書(shū)江;田萬(wàn)年;王暖成;;牛瑟氏泰勒蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的相關(guān)研究方法的建立[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

10 盧亦愚;;核酸等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法[A];2012年浙江省醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨革蘭陰性菌感染論壇論文集[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 記者 劉肖勇 通訊員 姜天海;深圳先進(jìn)院首創(chuàng)CRISPR等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)技術(shù)[N];廣東科技報(bào);2018年

2 朱望明;腹瀉病毒三重等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)誕生[N];中國(guó)國(guó)門(mén)時(shí)報(bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 杜文芳;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增及生物分析新方法研究[D];湖南大學(xué);2018年

2 路威;基于等溫?cái)U(kuò)增和DNAzyme的生化分析新方法的研究[D];浙江大學(xué);2019年

3 張棟;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)核酸及其在體育科研中的應(yīng)用[D];河北大學(xué);2019年

4 聶凱;等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)手足口病病原的研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2013年

5 夏峗;微流控等溫?cái)U(kuò)增核酸定性與定量檢測(cè)新方法研究[D];華中科技大學(xué);2016年

6 陳基耘;基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的數(shù)字核酸分析技術(shù)及其應(yīng)用研究[D];湖南大學(xué);2018年

7 謝順碧;基于納米材料和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器的研究[D];西南大學(xué);2016年

8 何琳;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病原的研究[D];浙江大學(xué);2012年

9 陳琛;核酸等溫?cái)U(kuò)增的集成化微流控芯片研究[D];華中科技大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 朱凱;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在摻假肉檢測(cè)中的應(yīng)用[D];河南科技大學(xué);2019年

2 肖磊;阿爾茲海默癥基因診斷技術(shù)的探索開(kāi)發(fā)[D];華僑大學(xué);2019年

3 付怡欣;基于連接反應(yīng)及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測(cè)新方法研究[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

4 羅媛;基于HCR與LAMP核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)生物大分子[D];湖南大學(xué);2017年

5 吳左次;改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在肺炎支原體檢測(cè)中的應(yīng)用[D];湖南大學(xué);2018年

6 楊通;等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)的研究[D];東南大學(xué);2018年

7 李陽(yáng);環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌方法的建立[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

8 萬(wàn)敏;基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的三種對(duì)蝦病原檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[D];暨南大學(xué);2018年

9 趙娜;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可視化檢測(cè)乙、丙型肝炎病毒的研究[D];承德醫(yī)學(xué)院;2017年

10 周航宇;等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在兒童肺炎中四種常見(jiàn)呼吸道病毒檢測(cè)中的臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2017年

，

本文編號(hào)：2696983