【摘要】：近年來,隨著科學技術的發(fā)展,蛋白質的檢測技術對于醫(yī)療診斷、藥物開發(fā)、生態(tài)安全等領域越來越重要。傳統(tǒng)的免疫反應檢測方法靈敏度低,特異性差。在這種情況下,蛋白質傳感器由于其高靈敏度、低成本及高穩(wěn)定性等優(yōu)點受到越來越多的關注�；诖�,我們構建了兩種蛋白質傳感體系。第一種是基于獨特的金屬-配體電荷轉移(MLCT)作用下的比色分析法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性。在ALP的作用下,底物抗壞血酸磷酸酯(AAP)被催化水解生成抗壞血酸,抗壞血酸可還原Cu2+變?yōu)镃u+。隨后,Cu+與二喹啉甲酸(BCA)結合生成顯色絡合物Cu(BCA)+,溶液顏色也由無色變?yōu)樽仙?并在562nm波長處有明顯吸收峰。該方法快速簡便,可通過肉眼定性觀察判斷ALP活性水平,同時,在0-200 mU mL-1的范圍內(nèi)有很好的線性范圍,檢測限達到1.25 mU mL-1。結果表明該方法具有良好的選擇性,在篩選抑制劑上也有很大潛力。更重要的是,該方法在檢測未稀釋的人體血清樣品的ALP水平時也表現(xiàn)出很好的檢測性能。第二種是基于末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)引發(fā)聚合的超靈敏檢測蛋白質芯片生物傳感器。利用兩個不同的凝血酶適配體來捕獲凝血酶分子,形成三明治結構來提高傳感器的特異性識別。其中一個末端修飾氨基的適配體固定在預處理后的硅基芯片表面,另一個適配體的3'末端暴露在硅片表面,利用TdT酶催化加尾的性質在適配體末端添加聚合帶有熒光素標記的dATP作為信號放大。在最優(yōu)試驗條件下,該三明治結構的生物傳感器在100 fM到0.1 μM的檢測范圍內(nèi)均有良好的線性關系,檢測下限達到8.35 fM。此外,該傳感器在人血清樣品中對凝血酶也有較好的檢測分析性能。以上兩種檢測體系均具有較高的靈敏度和選擇性,操作簡便,成本較低,可廣泛應用于疾病診斷、臨床預后、環(huán)境監(jiān)測等領域。
【圖文】：

．２．２實驗儀器逡逑ＣＨＩ７６０Ｄ電化學工作站（上海），使用０．５ＭＫＮＯ３溶液作為支持電解質，玻碳電極（ＧＣＥ（５邋＝邋３ｍｍ）作為工作電極，飽和甘汞電極（ＳＣＥ）作為參比電極，鉑絲作為對電極。紫外分光逡逑度儀（島津ＵＶ－３６００），ｌｃｍ光程的微量比色皿用于檢測。超純水儀（密理博Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）。逡逑．２．３實焌驟與方法逡逑．２．３．１實驗原理逡逑堿性磷酸酶活性的檢測原理如圖１所示。堿性磷酸酶的催化作用可以促進ＡＡＰ磷酸根的逡逑解，生成的抗壞血酸（ＡＡ）具有還原性，從而將溶液中的二價銅離子還原成一價銅離子。逡逑價銅離子與配體ＢＣＡ絡合形成Ｃｕ邋（ＢＣＡ）２＋的配合物作為顯色探針，會使溶液呈現(xiàn)明顯的紫逡逑，通過檢測紫外可見吸收光譜在５６２邋ｎｍ的波長處有特征峰，吸光系數(shù)為７７００邋ｃｎ＾Ｍ４。［４４］逡逑二價銅離子與ＢＣＡ在一起時則沒有明顯顏色。顏色深淺與其紫外可見吸收光譜上吸光度即逡逑反應出溶液中ＡＬＰ的濃度。據(jù)此構成一個用于檢測ＡＬＰ濃度的比色分析的生物傳感器。逡逑ＯＨ逡逑°

２．３結果與討論逡逑２．３．１可行性分析逡逑為了驗證該傳感器的可靠性與可行性，通過單一變量的方法進行研究，如圖２所示。將逡逑ＡＬＰ、ＡＡＰ、Ｃｕ２＋和ＢＣＡ各組分分別去除與原反應結果進行對比，，比較對照組與實驗組紫外逡逑可見吸收光譜的異同。明顯可見，在各組分都加入反應溶液的情況下在５６２邋ｎｍ處有一個明顯逡逑的吸收峰，而缺少了邋ＡＬＰ、ＡＡＰ、ＢＣＡ、Ｃｕ２＋或Ｃｕ２＋／ＢＣＡ的情況無明顯特征峰。另外，有ＢＣＡ逡逑存在的情況下，在３７０邋ｎｍ處有較強的吸收峰。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在３７０邋ｎｍ處的吸光度與ＢＣＡ逡逑配體的濃度有關，因此可以判斷出３７０邋ｎｍ處為ＢＣＡ配體的特征吸收峰。而在各組分完全的情逡逑況下，反應結束后溶液變?yōu)樽仙�，可以通過肉眼觀察比較顏色深淺來對ＡＬＰ濃度進行定性檢逡逑測。所以該傳感器的反應體系由于ＡＬＰ酶的催化性能，水解出的ＡＡ將二價銅離子還原為一逡逑價銅離子
【學位授予單位】：南京理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.1

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本文編號：2689660