【摘要】：目的:膿毒血癥(Sepsis)是感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào),且危及生命的器官功能障礙的一種臨床綜合征,通常繼發(fā)于嚴(yán)重感染、缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷、休克等。細(xì)菌性膿毒血癥的主要致病因素是內(nèi)毒素,由各種病原菌主要是革蘭氏陰性菌侵入機(jī)體后裂解釋放。內(nèi)毒素的主要成分是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),它可促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放大量的炎性因子,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)瀑布式爆發(fā),進(jìn)而引起多器官功能障礙。膿毒血癥病情進(jìn)展迅速,病死率達(dá)到20%。膿毒血癥合并心臟功能障礙稱為膿毒血性心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy;SIC),SIC病情兇險(xiǎn),死亡率達(dá)70%。關(guān)于SIC的研究雖不斷深入,但其發(fā)病機(jī)制仍未明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cell,EC)遍布于全身血管內(nèi)面,維持血液正常流動(dòng),同時(shí)也是血管壁重要的天然屏障。當(dāng)機(jī)體受到各種傷害刺激時(shí),如感染、缺血再灌注、創(chuàng)傷、休克等,EC是最先受到侵犯的細(xì)胞,致病因素突破血管內(nèi)膜后對全身各組織器官產(chǎn)生影響。EC在受到刺激后會(huì)釋放攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物活性物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),EVs介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息交流,其中外泌體(exosomes)受到廣泛關(guān)注。外泌體作為EVs的一個(gè)亞型,直徑約40-100nm,可攜帶微小RNA(microRNAs,miRNAs)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs對心肌細(xì)胞的功能存在調(diào)控作用,并對其作用機(jī)制有一定的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探索膿毒血癥時(shí)內(nèi)皮源性外泌體所攜帶的miRNAs與心臟功能障礙的關(guān)系及機(jī)制。方法:我們采用酶消化法培養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠胸主動(dòng)脈EC,以LPS刺激EC,對照組用PBS代替LPS。6小時(shí)后,收集兩組EC,采用miRNA測序篩選出差異性表達(dá)的miRNAs(FC1.5,P0.05)。檢測發(fā)現(xiàn)LPS刺激后EC的miR-155-5p表達(dá)顯著增高。通過低溫差速離心法聯(lián)合聚乙二醇沉淀法獲取內(nèi)皮源性外泌體,檢測發(fā)現(xiàn)LPS刺激后EC源性外泌體中miR-155-5p表達(dá)也顯著增高。原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CMC),通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miRNA-155-5p轉(zhuǎn)染至CMC,檢測CMC中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和BAX/BCL-2蛋白相對表達(dá)量,CCK-8檢測細(xì)胞活性,評估CMC氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞損傷程度。結(jié)果:1、通過膠原酶消化法分離及培養(yǎng)出的血管EC成熟度、活性及純度均滿足實(shí)驗(yàn)要求。通過胰蛋白酶聯(lián)合II型膠原酶消化法,得到穩(wěn)定可靠的、純度高、活力強(qiáng)的CMC。2、低溫差速離心法聯(lián)合聚乙二醇沉淀法所提取的外泌體,純度高、活性好,經(jīng)電鏡鑒定具有典型的外泌體特征。3、EC在LPS刺激下高表達(dá)多種microRNAs,其中miR-155-5p可通過外泌體釋放到細(xì)胞外。4、在體外實(shí)驗(yàn)中,miR-155-5p介導(dǎo)乳鼠CMC的氧化應(yīng)激且促進(jìn)凋亡。結(jié)論:血管EC在受到LPS刺激時(shí)可產(chǎn)生富含miR-155-5p的外泌體,外泌體通過旁分泌作用或外周循環(huán)到達(dá)并作用于CMC,介導(dǎo)膿毒血癥時(shí)CMC氧化應(yīng)激并促進(jìn)凋亡,這可能是膿毒性心肌病的重要原因。
【圖文】：

圖 2.SD 大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（標(biāo)尺：20μm）Figure.2. Immunofluorescence of SD rat thoracic aortic endothelial cells(bar:20μm)1.2 乳鼠心肌細(xì)胞（1）心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下可見，剛分離出來的心肌細(xì)胞大多數(shù)為懸浮的不貼壁的圓球形，可見極少數(shù)的不規(guī)則形細(xì)胞；培養(yǎng) 24 小時(shí)后心肌細(xì)胞逐漸貼壁生長，呈梭形或多邊形，折光度較強(qiáng)；培養(yǎng) 48h 后已貼壁的心肌細(xì)胞伸出偽足相互連接呈細(xì)胞簇（圖 3）。

圖 3.乳鼠心肌細(xì)胞（標(biāo)尺：10μm）Figure.3. Neonatal rat cardiomyocytes (bar:10μm)（2）心肌細(xì)胞的鑒定熒光顯微鏡下可見心肌細(xì)胞內(nèi)的綠色骨架和藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，，肌橫紋呈不規(guī)形，熒光分布一致，即分離培養(yǎng)的細(xì)胞為
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2674876