【摘要】：目的近三十年高毒力肺炎克雷伯菌(Hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hv KP)在亞洲太平洋地區(qū)和西方國家被越來越多地報道。hvKP能引起嚴重的遷移性感染如肝膿腫,眼內炎,腦膜炎等。目前基于基因組背景的hvKP研究較少,限制了我們從全基因組水平了解hvKP,因此我們對6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌進行全基因組測序及比較基因組學分析,增加對hv KP基因組水平的了解,為近一步探討其致病機制奠定基礎。方法首先PCR篩選出6株高毒力血清型菌株,用拉絲試驗(string test,ST)測定6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌的超黏性。其次,提取細菌全基因組DNA后通過Illumina Hise4000測序平臺對6株hvKP進行全基因組測序,測序下機的數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后使用SOAPdenovo短序列組裝軟件進行組裝,采用Glimmer軟件進行組裝結果的基因預測,將預測的基因翻譯成氨基酸,在KEGG和COG庫進行比對和基因功能注釋。基于測序樣品基因組序列、基因集序列和參考序列NTUH-K2044基因組進行比較基因組學分析,從而展現(xiàn)測序樣品與參考序列的差異及進化關系,包括結構變異(共線性)、基因家族聚類分析、特有基因、SNP和InDel檢測、進化分析。最后用VFDB數(shù)據(jù)庫預測基因組中的毒力基因,同時結合文獻報道分析篩選出肺炎克雷伯菌的毒力基因,并在NCBI核酸庫下載所選毒力基因的參考序列,將下載的參考序列分別與6株hvKP的全基因組序列進行BLAST比對分析以確定毒力基因在6株hvKP中的分布情況。同時對檢測到的毒力基因做基于SNP的變異分析,進而推測影響細菌致病力的毒力相關基因。結果拉絲試驗結果顯示6株hvKP均為超黏性菌株。基因組測序組裝結果顯示6株hvKP的基因大小在5.34Mb到5.58 Mb之間,GC含量57.22%-57.46%。比較基因組分析顯示7株hvKP的基因組之間的共線性較好,基因組之間存在插入、缺失現(xiàn)象,基因組存在較多的易位、倒位等基因組重排事件。通過與參考株NTUH-K2044序列進行比對,我們發(fā)現(xiàn)6株hvKP存在非常豐富的SNP和InDel多態(tài)性。基于SNP的進化樹結果表明6株hvKP與NTUH-K2044分別處于兩個進化分支上,進化距離較遠,5株非K1血清型的hvKP有更近的進化距離。BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)一些毒力基因例如kfu,allS,iucABCDiutA等在5株非K1型hvKP全基因組序列中的分布不同。同時基于SNP的毒力基因變異分析也顯示一些毒力基因例如mrkD,ureDABCEFG等基因發(fā)生不同程度的SNP突變。結論本研究通過對6株hvKP進行全基因組測序分析以及和NTUH-K2044基因組的比較分析,對hvKP的基因組組成,基因多態(tài)性,進化情況及毒力基因情況有了基本的了解。這6株hvKP的基因組背景為我們進一步對hvKP進行基因研究和致病機制的深入研究奠定基礎。
【圖文】：

圖 1 6 株 hvKP 在血平板上的超黏性實驗Fig1. String test of 6 hypervirulent Klebsiella pneumoniae3.2 基因組 DNA 的提取本研究采用傳統(tǒng)的 SDS-氯仿抽提基因組 DNA，，DNA 濃度、A260/280 比值、A260/A230 比值如表 2 所示，結果顯示提取的基因組 DNA 質量適合建庫測序要求，且總量可以用于 2 次或者 2 次以上建庫需要表 2 6 株 hvKP 基因組 DNA 樣品濃度Table2 DNA sample concentration of 6 hvKP strains菌株 ID 濃度（ng/ul） 體積（ul） A260/A280 A260/A230K038 722.3 100 1.91 1.75K090 384.5 100 1.90 1.99K095 690.9 100 1.91 2.05K323 414.3 100 1.84 1.87

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文3.5 高毒力肺炎克雷伯菌比較基因組學分析3.5.1 基因組共線性分析用 Mauve2.3.1 軟件使用默認參數(shù)，對 7 株高毒力肺炎克雷伯菌的全基因組進行共線性比較，比對結果見圖 2。由于 6 株 hvKP 基因組序列信息并非完整的，所用于比對時用的是其重疊群（Contig）序列，因此基因組的共線性比對顯得較為雜亂但總體上來說，7 菌株有很多相同顏色的共線性模塊（Locally collinear blocks,LCBs ），基因組一致性還是比較高的；7 株菌基因組之間存在插入、缺失現(xiàn)象，而且基因組存在較多的倒位、易位等基因組重排事件。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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1 和晉渝;肺炎克雷伯菌的血清分型及毒力基因分布的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2656434