【摘要】：肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,拉丁語簡稱M.pneumoniae)是引起上呼吸道感染的主要病原菌之一,也是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎的常見原因。隨著近年來環(huán)境中空氣質(zhì)量下降,患有呼吸道感染疾病的人越來越多,呼吸道感染疾病診斷逐漸成為人們關(guān)注的焦點。由肺炎支原體引起的呼吸道感染與普通感冒癥狀并無差異,但如未及時診斷治療可能會造成患者全身多處臟器損傷和器質(zhì)性病變,嚴重者危及生命。因此,發(fā)展一種準確、快速的肺炎支原體檢測方法是十分有意義的。本研究以肺炎支原體為研究對象,利用變性泡介導(dǎo)的鏈交換擴增(Denaturation bubble-meditated strand exchange amplification,SEA)方法對肺炎支原體進行核酸快速檢測方法的研究,主要的研究內(nèi)容與結(jié)論如下:1.痰液樣品中肺炎支原體核酸提取方法比較研究:以肺炎支原體感染患者痰液為樣本,將肺炎支原體感染患者痰液消化處理后通過苯酚-氯仿核酸提取法、磁珠核酸提取方法、離心柱核酸提取方法分別對等體積的痰液進行核酸提取并將提取液進行濃度、吸光度比值以及其他幾個方面的評估,選取一種最優(yōu)的肺炎支原體感染痰液核酸提取方法。結(jié)果表明:離心柱核酸提取方法提取核酸濃度范圍為255.6-440.3ng/μL,磁珠核酸提取方法核酸濃度范圍為110-186.9 ng/μL,苯酚-氯仿法提取核酸濃度范圍為11.6-27.5 ng/μL。從OD260/280與OD260/230比值來比較三種核酸提取方法的核酸提取純度,離心柱、磁珠與苯酚-氯仿三種核酸提取方法OD260/280比值范圍分別為2.51-3.15、1.53-1.93、1.32-1.85。離心柱、磁珠與苯酚-氯仿三種核酸提取方法OD260/230比值范圍分別為2.77-3.22、0.52-1.98、0.32-1.75。結(jié)論:通過三種方法對痰液中肺炎支原體核酸提取的濃度、吸光度比值、提取時間、擴增效率分析比較,離心柱核酸提取方法為三種提取方法中最優(yōu)的核酸提取方法。2.基于鏈交換擴增新方法對肺炎支原體核酸快速檢測方法的建立:以肺炎支原體為靶標,將SEA方法應(yīng)用于肺炎支原體的檢測,從該方法的引物設(shè)計、可行性、溫度優(yōu)化、靈敏性、特異性、結(jié)果可視化等方面進行研究,建立一種新型的肺炎支原體檢測方法。結(jié)果表明,SEA方法檢測肺炎支原體反應(yīng)最適溫度是61℃,最低檢測限為1×10~4 copy/mL。引物具有良好特異性,可以與11種上呼吸道感染致病菌進行區(qū)分。通過向反應(yīng)管中加入本實驗室研制比色染料實現(xiàn)了該方法反應(yīng)結(jié)果肉眼可視化。結(jié)論:SEA等溫擴增新方法可以應(yīng)用于肺炎支原體檢測,檢測限達到臨床肺炎支原體感染最低檢測標準,并且反應(yīng)結(jié)果借助比色染料實現(xiàn)了可視化,不需要依賴大型的熒光PCR儀來觀察結(jié)果。3.SEA方法檢測實際樣品與對比研究:利用SEA肺炎支原體檢測方法與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)和聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)方法分別對224例上呼吸道感染患者進行檢測,比較三種方法對實際樣品檢測的準確性。SEA、LAMP、PCR檢測方法針對224例上呼吸道感染痰液樣品分別檢測出38、41、42例肺炎支原體感染陽性樣本,但LAMP方法在對實際樣品檢測中檢出2例假陽性結(jié)果,三種方法準確率分別為90.50%、97.6%、100%。同時分析了三種方法在反應(yīng)起峰時間、引物數(shù)量、檢測限和反應(yīng)溫度等方面的不同點。結(jié)論:SEA檢測肺炎支原體方法對上呼吸道感染實際樣品檢出率略低于PCR與LAMP方法,但該方法在引物數(shù)量,反應(yīng)時間,反應(yīng)條件等方面均具有自身優(yōu)勢。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R440

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本文編號：2652769