【摘要】：目的:本研究旨在發(fā)展一種利用滾環(huán)擴增技術直接檢測miR-93-5p快速簡便的方法,同時與RT-qPCR方法檢測miR-93-5p的結果進行比較,考察兩種方法的檢測靈敏度和檢測特異性的差異。為了得到預期的檢測結果,分別考察了環(huán)形模板的二級結構等不同因素,以miR-93-5p的檢測為例,探討不同二級結構的鎖式探針對滾環(huán)擴增的影響,同時篩選出一條最優(yōu)的鎖式探針鏈用于檢測miR-93-5p。研究方法:1、RNA structure軟件預測不同二級結構的鎖式探針。2、細胞培養(yǎng)。3、利用RCA方法檢測細胞中的miR-93-5p。4、利用RT-qPCR方法檢測細胞中的miR-93-5p。5、瓊脂糖凝膠電泳。6、聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果:1、本研究所用最優(yōu)鎖式探針是無二級結構的鎖式探針1。2、鎖式探針和連接序列的最優(yōu)環(huán)化連接終濃度為500 nmol/L。3、環(huán)化連接最優(yōu)時間為4 h。4、環(huán)化產物最優(yōu)酶切時間為9 h。5、RCA檢測miR-93-5p的靈敏度范圍為1 pM~10~4 pM。6、PCR檢測miR-93-5p的靈敏度范圍為10 pM~10~4 pM。7、RCA和PCR方法檢測miR-93-5p均具有良好的特異性。8、RCA和PCR方法均可從實際樣品中檢出miR-93-5p,兩種方法均適用于實際檢測。結論:1、建立了一種基于滾環(huán)擴增的恒溫檢測平臺,開發(fā)了一種快捷、簡便、靈敏、特異、半定量、經濟有效的檢測miR-93-5p的新技術。2、我們用RCA和PCR兩種方法檢測miR-93-5p,系統(tǒng)的比較了RCA方法和PCR方法檢測miR-93-5p的靈敏度和特異性。其中,RCA方法的檢測范圍是1 pM~10~4pM,PCR方法的檢測范圍是10 pM~10~4 pM,RCA方法較PCR方法的檢測靈敏度相近。RCA和PCR方法的特異性均良好,可特異的檢測出miR-93-5p。
【圖文】：

在激發(fā)光的激發(fā)作用下產生強熒光，，通過酶標儀收集熒光信號的變化，從而達到檢測miR-93-5p 的目的。反應原理如圖1 所示。圖1. 滾環(huán)擴增檢測 miR-93-5p 原理圖

預測的鎖式探針2的二級結構圖
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R440

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本文編號：2591026