【摘要】：本論文由兩部分組成,第一部分是細(xì)胞膽固醇代謝與造血干細(xì)胞的增殖分化研究,第二部分是短時高溫致紅細(xì)胞損傷的機制研究。第一部分:目的通過pLKO.1-NPC1/NPC2 shRNA重組慢病毒感染EML(erythroid myeloid lymphoid,EML)細(xì)胞獲得NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞模型,進而探討NPC1、NPC2對EML細(xì)胞增殖分化的影響。方法通過NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重組慢病毒感染EML細(xì)胞獲得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML細(xì)胞模型。利用該模型以Filipin染色檢測NPC1、NPC2基因敲低后對EML細(xì)胞內(nèi)膽固醇分布的影響,以CCK-8和臺盼藍染色進行增殖檢測,以流式細(xì)胞術(shù)檢測NPC1、NPC2基因沉默后EML細(xì)胞干性標(biāo)志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的改變,利用Western blot分析SCF刺激細(xì)胞后c-kit磷酸化的改變。結(jié)果成功構(gòu)建NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞模型,NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白水平表達均顯著降低(P0.01)。NPC1、NPC2敲低的EML細(xì)胞中出現(xiàn)膽固醇蓄積,且在NPC1敲低的EML細(xì)胞模型中膽固醇蓄積更顯著。沉默NPC1、NPC2基因后使得EML細(xì)胞增殖減慢(P0.01),并且能夠降低EML細(xì)胞CD34、sca-1和TER-119、B220的陽性率(P0.01)。經(jīng)SCF刺激后NPC1基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit的磷酸化降低顯著(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit磷酸化的改變并無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)基因NPC1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇流動參與了EML細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是機體具有組織特異性的一群細(xì)胞,為了維持正常的造血功能其可通過不對稱分裂(asymmetric division)在調(diào)節(jié)自身數(shù)量穩(wěn)定的同時生成多系和/或單系造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs)。正常生理情況時,機體HSCs的含量和各系造血祖細(xì)胞的數(shù)量維持在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。當(dāng)這個穩(wěn)定平衡狀態(tài)被打破,HSCs的量急劇增多或哪一系或多系造血祖細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著改變都將引發(fā)疾病。究其機制,過去大量的研究主要聚焦在免疫系統(tǒng)。近年來,有研究顯示細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出對HSCs和HPCs穩(wěn)態(tài)維持起著重要作用。三磷酸腺苷結(jié)合蛋白ABCA1和ABCG1通過把HSCs和HPCs內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運至高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)而將其運出細(xì)胞,當(dāng)ABCA1和ABCG1缺失時上述膽固醇轉(zhuǎn)運途徑障礙,將使得造血祖細(xì)胞恢復(fù)造血功能,同時出現(xiàn)髓外造血。此外,巨核細(xì)胞祖細(xì)胞(megakaryocyte progenitor cells,MPCs)內(nèi)膽固醇外流障礙將引發(fā)血小板增多綜合征,與ABCG1高度同源的三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白ABCG4在巨核細(xì)胞祖細(xì)胞中的缺失將使得胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運至HDL障礙,進而引發(fā)細(xì)胞膜促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受體(c-MPL)表達增多,最終引發(fā)疾病。在動脈粥樣硬化的小鼠在體模型中載脂蛋白E(apo lipoprotein E,ApoE)通過影響ABCA1和ABCG1的功能而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出進而調(diào)控HSCs增殖且與單核細(xì)胞增多相關(guān)。除此之外,NPC1、NPC2基因在膽固醇流出細(xì)胞的過程中同樣起著關(guān)鍵作用。NPC1基因的缺失將引發(fā)以膽固醇轉(zhuǎn)運障礙為特征的尼曼匹克病(NPC1),患者主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的大量膽固醇聚集和神經(jīng)功能障礙,同時患者也存在造血功能障礙,但是機制不清楚,還需要探討。為了探索NPC1、NPC2基因調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞生物學(xué)特性,特別是增殖和分化特征,本課題以造血干細(xì)胞系EML(erythroid myeloid lymphoid)作為模型,通過基因表達分析、基因功能分析研究NPC1、NPC2基因?qū)ML細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控及其機制。首先我們根據(jù)EML細(xì)胞干性標(biāo)志sca-1不同水平的表達,通過細(xì)胞流式技術(shù)分離sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 3個細(xì)胞亞群,檢測各亞群細(xì)胞中NPC1和NPC2基因的表達,分析NPC1、NPC2基因表達與EML細(xì)胞干性的關(guān)聯(lián)。其次,通過基因沉默技術(shù)敲降(knock-down)EML細(xì)胞NPC1和NPC2基因,分析NPC1和NPC2對EML細(xì)胞增殖和分化的影響。最后,通過分析NPC1和NPC2基因?qū)CF介導(dǎo)c-kit磷酸化的影響,探討NPC1和NPC2調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的機制。本研究得到的主要結(jié)果有:在EML細(xì)胞中NPC1和NPC2基因的表達與sca-1呈正相關(guān)。利用NPC1、NPC2基因慢病毒成功構(gòu)建了NPC1、NPC2基因敲低的EML細(xì)胞模型。Filipin染色結(jié)果顯示,與對照相比,在NPC1和NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中膽固醇顯著蓄積,且NPC1基因沉默的EML細(xì)胞中膽固醇蓄積更顯著。NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞生長明顯慢于對照細(xì)胞(P0.01),表明NPC1和NPC2基因參與了EML細(xì)胞的增殖調(diào)控。同時,NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞CD34和sca-1的陽性率顯著降低(P0.01),提示NPC1、NPC2沉默以后能夠使EML細(xì)胞的分化能力降低。在幾種細(xì)胞中粒系標(biāo)志物CD11b所占比例均較低,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明NPC1、NPC2基因敲低后對EML細(xì)胞向粒系的分化并無影響;而在NPC1沉默的EML細(xì)胞中TER-119所占比例顯著低于其余3種細(xì)胞(P0.01),說明NPC1基因的沉默能夠抑制EML細(xì)胞向紅系分化;B220所占比例在NPC1、NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中顯著降低(P0.01),表明沉默NPC1、NPC2基因能夠抑制EML細(xì)胞向淋巴系分化。SCF刺激細(xì)胞后,NPC1基因沉默的EML細(xì)胞c-kit磷酸化受到明顯抑制(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML細(xì)胞中c-kit的磷酸化改變并無統(tǒng)計學(xué)差異。提示,NPC1基因參與了EML細(xì)胞c-kit的磷酸化調(diào)控。利用細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運阻斷劑U18666A、細(xì)胞膜膽固醇剝離劑beta-CD、游離膽固醇處理EML細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),經(jīng)U18666A、beta-CD處理后EML細(xì)胞c-kit的磷酸化顯著降低(P0.01),與NPC1基因沉默對c-kit磷酸化的影響一致;并且,當(dāng)聯(lián)合使用beta-CD和膽固醇處理后相較于前者,EML細(xì)胞c-kit的磷酸化有所升高(P0.01),提示NPC1對SCF介導(dǎo)的EML細(xì)胞c-kit磷酸化的影響是通過改變細(xì)胞膜膽固醇含量實現(xiàn)的。第二部分:紅細(xì)胞(Red blood cells,RBC)是哺乳動物血液中數(shù)量最多的血細(xì)胞,RBCs除了是氧氣運輸?shù)闹饕浇檫�是重要的免疫細(xì)胞。RBCs生成于骨髓,在體內(nèi),新生的RBCs平均壽命為120d,并將經(jīng)歷輕齡、中齡、老齡3個階段,最終衰老的RBCs被機體免疫系統(tǒng)清除,或是在經(jīng)過肝臟時被枯否細(xì)胞(Kupffer Cells)分解為膽汁。但在病理狀態(tài)下RBCs的衰老死亡將加劇。細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),高溫能夠引起細(xì)胞質(zhì)膜變形,形成凸起狀泡。在一定程度上,泡的形成是自適應(yīng)的,從而增加細(xì)胞的存活率。但是細(xì)胞受熱越嚴(yán)重起泡程度越大,并且細(xì)胞死亡率越高。廣泛的數(shù)據(jù)顯示,高熱、熱射病時體溫升高治療不及時或治療不完善將導(dǎo)致紅細(xì)胞減少甚至貧血,但究其機制還尚不清楚,亟待進一步研究。為了觀察短時高溫引起紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化,探討高熱(中暑)引起紅細(xì)胞損傷的機制。本研究取健康志愿者的靜脈血,分別在37℃(對照組)和42℃(實驗組)下孵育10 min,Percoll密度梯度離心法分離不同細(xì)胞年齡的紅細(xì)胞,測定其Zeta電位值,分析不同年齡紅細(xì)胞所占比例的改變;同時,我們利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞大小、細(xì)胞凋亡以及紅細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化,探討高溫對紅細(xì)胞衰老、凋亡的影響。本研究得到的主要結(jié)果有:與37℃相比,42℃下實驗組的紅細(xì)胞表面電荷顯著降低(P0.05),紅細(xì)胞體積顯著減小(P0.05),凋亡顯著增加(P0.05),細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加(P0.05)。最終發(fā)現(xiàn),短時高溫能引起紅細(xì)胞理化性質(zhì)的改變,進而導(dǎo)致紅細(xì)胞衰老、凋亡加劇,這可能是急性高熱(中暑)引起血液系統(tǒng)病理改變的機制。
【圖文】：

19A-B: 流式分選 EML 細(xì)胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 各亞細(xì)胞群；C-D:q-PCR 檢測 EML細(xì)胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 亞細(xì)胞群基因 NPC1、NPC2 的表達，1：EML/sca-1-high，2：EML/sca-1-inter，3：EML/sca-1-low;；a：P＜0.01，，與 sca-1-high, sca-1-inter 比較圖 1 EML 細(xì)胞 NPC1、NPC2 基因的表達與 sca-1 的相關(guān)性分析2.5 討 論NPC1、NPC2 基因編碼的蛋白主要分布于細(xì)胞溶酶體，在細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。NPC1 和可溶性膽固醇結(jié)合蛋白 NPC2 共同作用，將細(xì)胞攝取和合成的膽固醇從 LE/Ly 轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞漿膜和其他細(xì)胞器膜[6]。其中分布于細(xì)胞膜的膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜脂質(zhì)筏的主要成分，能夠維持脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)和功能的完整。脂質(zhì)筏是細(xì)胞膜上含有眾多信號分子的微區(qū)，介導(dǎo)了多條信號通路的轉(zhuǎn)

34細(xì)胞 NPC1 和 NPC2 基因的表達 a:P＜0.01, 與各細(xì)胞NPC1和NPC2基因編碼蛋白的表達水平：EML/NPC2shRNA；C：半定量分析 n=3, a:P＜圖 3 NPC1 和 NPC2 基因沉默的 EML 細(xì)胞驗證
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

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1 劉廷析;劉廷析;;造血干細(xì)胞研究進展[J];生命科學(xué);2009年05期

本文編號：2546462