有機(jī)磷農(nóng)藥因具有高效、種類繁多、低價(jià)等特點(diǎn)而被廣泛使用。由于有機(jī)磷農(nóng)藥的過度使用導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染及非靶向生物體有嚴(yán)重的毒性。因此加強(qiáng)對(duì)環(huán)境、食品中的有機(jī)磷農(nóng)藥含量的檢測(cè)十分重要。檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥含量最常用的酶抑制法所用的酶源為乙酰膽堿酯酶（AChE）。 AChE作為重要的酶源在檢測(cè)中仍存在以下問題：靈敏度有待提高；其次因有機(jī)磷類農(nóng)藥數(shù)量龐大,單一AChE無法滿足所有有機(jī)磷化合物檢測(cè)。因此我們希望通過生物技術(shù),以AChE結(jié)構(gòu)類似丁酰膽堿酯酶BChE作為改造對(duì)象以期能夠獲得靈敏度更好,檢測(cè)范圍更廣的酶源。BChE與AChE在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上相似,且早期已有科學(xué)家嘗試用丁酰膽堿酯酶來作為檢測(cè)的酶源。通過對(duì)BChE結(jié)構(gòu)的深刻學(xué)習(xí)和認(rèn)識(shí),我們對(duì)人源丁酰膽堿酯酶ABChE活性腔中部分重要位點(diǎn)的改造,利用定點(diǎn)突變、真核表達(dá)、蛋白質(zhì)純化以及酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)等手段共得到近40個(gè)ABChE突變體,并且成功建立了突變ABChE檢測(cè)有機(jī)磷的篩選模型。通過雙分子速率常數(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)hAChE對(duì)丙溴磷無法識(shí)別,ABChE較hAChE對(duì)敵敵畏、丙溴磷、辛硫磷識(shí)別效果更佳。而通過突變體篩選,找到F227、S287、N68、P28... 

【文章來源】：華中師范大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 背景介紹
    1.1 有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究進(jìn)展
        1.1.1 有機(jī)磷農(nóng)藥簡(jiǎn)介
        1.1.2 有機(jī)磷農(nóng)藥的特點(diǎn)
        1.1.3 有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析方法
        1.1.4 不同殘留檢測(cè)的方法的比較
    1.2 酶抑制法用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的研究進(jìn)展
        1.2.1 膽堿酯酶的性質(zhì)、功能以及晶體結(jié)構(gòu)
        1.2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥與膽堿酯酶的相互作用研究
        1.2.3 現(xiàn)有改造膽堿酯酶的研究進(jìn)展
    1.3 選題依據(jù)和研究思路
第二章 靶向機(jī)磷農(nóng)藥殘留的丁酰膽堿酯酶突變體的合理設(shè)計(jì)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液的配置
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 定點(diǎn)突變
        2.2.2 氯化鈣方法制備感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.3 質(zhì)粒在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
        2.2.4 試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)定所提取質(zhì)粒的濃度和純度
        2.2.5 瓊脂糖核酸電泳
        2.2.6 人體胚腎細(xì)胞Hek293的培養(yǎng)
        2.2.7 質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染表達(dá)
        2.2.8 SDS-聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)
        2.2.9 丁酰膽堿酯酶突變體的純化方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.3.1 粗酶液的獲得
        2.3.2 酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)體系
    2.4 實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理
        2.4.1 測(cè)活原理
        2.4.2 酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m和v_(max)的處理方法
        2.4.3 酶與有機(jī)磷農(nóng)藥的雙分子速率常數(shù)k_i解離常數(shù)K_d磷�；俾食�(shù)k_p
    2.5 本章小結(jié)
第三章 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)丁酰膽堿酯酶突變體的抑制動(dòng)力學(xué)研究
    3.1 突變丁酰膽堿酯酶的獲得
        3.1.1 人丁酰膽堿酯酶突變位點(diǎn)的確定
        3.1.2 人丁酰膽堿酯酶突變體質(zhì)粒的獲得
        3.1.3 突變酶的表達(dá)
        3.1.4 代表性突變體A328W的純化結(jié)果
    3.2 酶與底物動(dòng)力學(xué)表征
        3.2.1 突變體對(duì)底物硫代乙酰膽堿(ATC)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.3 四種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)丁酰膽堿酯酶及其突變體的抑制
        3.3.1 乙酰膽堿酯酶對(duì)四種有機(jī)磷的k_i的測(cè)定
        3.3.2 丁酰膽堿酯酶對(duì)四種有機(jī)磷的k_i的測(cè)定
        3.3.3 各種突變體對(duì)四種有機(jī)磷的初篩
        3.3.4 高親和性突變體A328W的動(dòng)力學(xué)表征
    3.4 本章小結(jié)
第四章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
研究成果及發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3249273