【摘要】：氮素(N)是地球上最多的元素之一,但是在很多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中常以植物不可利用的形態(tài)存在,因此N成為限制植物生長的主要因素。低投入系統(tǒng)中,常因?yàn)橛袡C(jī)物料礦化緩慢,造成N缺乏,進(jìn)而影響作物生長。因此有機(jī)系統(tǒng)產(chǎn)量相比常規(guī)系統(tǒng)較低�？紤]到在低投入系統(tǒng)中N素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵作用,研究N動(dòng)態(tài)變化過程對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐顯得尤為重要。很多研究認(rèn)為植物可以吸收和同化有機(jī)氮,有機(jī)氮具有作為重要N源的潛能。近年來,許多研究針對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)土壤有機(jī)氮庫進(jìn)行了定量分析,而針對(duì)農(nóng)田系統(tǒng)氮庫的研究鮮有報(bào)道。微生物群落的結(jié)構(gòu)和變化過程在生物地球化學(xué)之間養(yǎng)分的循環(huán)中起關(guān)鍵作用,如受細(xì)菌和真菌介導(dǎo)的有機(jī)質(zhì)降解和營養(yǎng)循環(huán)過程。大氣固氮作用同樣需要借助原核生物產(chǎn)生的固氮酶來發(fā)揮作用,它是許多生態(tài)系統(tǒng)的重要過程,同時(shí)也是低投入系統(tǒng)N素的重要來源。本課題組前期已對(duì)菜田土壤進(jìn)行了一定程度的研究并在菜田土壤有機(jī)氮庫的組成和分布方面取得了一定的成果,因此,進(jìn)一步研究栽培模式和土壤理化性質(zhì)如何影響土壤中參與N轉(zhuǎn)化的微生物群落結(jié)構(gòu)及其分布和豐度可更好地理解農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中氮的生物地球化學(xué)循環(huán)并為土壤可持續(xù)利用服務(wù)。本文以上海地區(qū)蔬菜生產(chǎn)系統(tǒng)為研究對(duì)象,采用固氮微生物群落的標(biāo)記基因nifH,研究一年內(nèi)不同生產(chǎn)方式(有機(jī)、常規(guī))和不同栽培方式(溫室和露地)園藝系統(tǒng)的固氮菌群落DNA的條帶和RNA的活性差異。用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究固氮菌群落結(jié)構(gòu)變化。用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)測(cè)定nifH-harboring bacteria的豐度。將突出的DGGE條帶切下后測(cè)序用以研究固氮菌的種系組成。土壤樣品于2010年7月、11月、2011年2月和5月分別采自上海崇本堂有機(jī)生態(tài)農(nóng)場(chǎng)和葉榭蔬菜園藝場(chǎng)。上海崇本堂有機(jī)生態(tài)農(nóng)場(chǎng),已有6年有機(jī)蔬菜栽培歷史;葉榭蔬菜園藝場(chǎng)有10年蔬菜常規(guī)種植歷史。兩種生產(chǎn)系統(tǒng)均包括露地和設(shè)施大棚兩種栽培模式,大棚和露地相鄰,土壤環(huán)境一致。在上述兩個(gè)地區(qū)4個(gè)處理(有機(jī)大棚、有機(jī)露地、常規(guī)大棚、常規(guī)露地)各選擇3個(gè)典型地塊作為三個(gè)重復(fù),每地塊面積45m×50m。所選小區(qū)均具有相同的作物和茬次及其他農(nóng)田管理措施。每個(gè)小區(qū)按s形用取土器取0-20cm土層土壤樣品8個(gè)點(diǎn)并混合作為一個(gè)重復(fù)。取樣后去除可見植物殘?jiān)�、石子等雜物,立刻存于自封袋內(nèi),放于事先準(zhǔn)備好的冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。用相同的土壤樣品,以土壤微生物dna和rna的18srrna為目的片段,用pcr-dgge技術(shù)研究了土壤真菌群落多樣性。本研究進(jìn)一步測(cè)定了與土壤微生物相關(guān)的土壤的特性(如:總碳、電導(dǎo)率、無機(jī)氮庫、有機(jī)氮庫和ph),確定影響真菌群落的土壤理化因子。另外,我們向有機(jī)和常規(guī)土壤中分別添加相同n量的:尿素,苜蓿、稻稈和堆肥,用以研究有機(jī)管理和肥料對(duì)氨基酸組分和含量的影響。試驗(yàn)土壤于2013年3月,在上海崇本堂農(nóng)場(chǎng)有機(jī)和常規(guī)生產(chǎn)系統(tǒng)露地種植區(qū)獲取,采樣方法同上。試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理:常規(guī)土壤,常規(guī)土壤+尿素,常規(guī)土壤+苜蓿,有機(jī)土壤,有機(jī)土壤+有機(jī)肥,有機(jī)土壤+尿素,有機(jī)土壤+秸稈,有機(jī)土壤+苜蓿。將尿素、苜蓿、有機(jī)肥、秸稈按照0.1mgng-1干土添加到250g土壤中,混合均勻放入580ml梅森瓶,每處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)瓶置于人工氣候室,20±1℃,黑暗條件培養(yǎng),人工補(bǔ)水保持土壤含水量在最大持水量的50%。在培養(yǎng)的第1、3、7、15、28、42和56d破壞性取樣,測(cè)定土壤中氨基酸組分和含量,無機(jī)氮和微生物n含量。為研究肥料對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)用pcr-dgge的方法分別以16s和18srdna為目的片段研究細(xì)菌和真菌群落。將dgge圖譜中的dna目的條帶測(cè)序后得到群體結(jié)構(gòu)的分類信息。培養(yǎng)過程中測(cè)定微生物群體,脫氫酶活性和呼吸作用的變化用以評(píng)價(jià)各處理對(duì)土壤質(zhì)量的影響和肥料降解的動(dòng)態(tài)變化。為了解有機(jī)土壤和所添加肥料對(duì)固氮能力的影響,采用靈敏度高的乙炔還原法(ara)周期性測(cè)定土壤培育過程中固氮酶活性。同時(shí),測(cè)定其它土壤理化參數(shù)和生物參數(shù)以便確定對(duì)固氮能力影響最大的參數(shù)因子。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)以nifh為目的片段采用dna-dgge的方法分析土壤的固氮菌群落。主要研究結(jié)果如下:(1)dgge圖譜聚類分析表明,在溫室種植模式中,有機(jī)生產(chǎn)管理的方式影響微生物群落結(jié)構(gòu),但是在露地種植模式下無此現(xiàn)象,從全碳的含量與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性可以看出,兩種種植模式下施肥量的差異是造成該現(xiàn)象的主要原因。結(jié)果表明,定量pcr表明有機(jī)管理方式增加了固氮細(xì)菌的豐度和活性。在有機(jī)管理模式下和相對(duì)溫暖的月份,可溶性有機(jī)氮(son)含量較高,并與固氮細(xì)菌呈現(xiàn)了較好的相關(guān)性。圖譜中鑒定出的序列主要?dú)w屬于固氮細(xì)菌、β-變性菌門、γ-變性菌門和α-變性菌門。其中24個(gè)條帶與pseudomonasstutzeri相似,8個(gè)條帶與azoarcusspp.相似。研究結(jié)果表明栽培模式可以改變季節(jié)和有機(jī)管理對(duì)固氮細(xì)菌影響的程度,大棚栽培可以顯著加強(qiáng)有機(jī)管理方式對(duì)固氮細(xì)菌的影響。同時(shí),有機(jī)管理方式可以加強(qiáng)季節(jié)溫度對(duì)固氮細(xì)菌豐度和活性的影響從而增加生物固氮速率。同時(shí),土壤dna和rna的聯(lián)合分析也給固氮菌群落提供了綜合的描述。(2)土壤dna指紋圖譜表明,真菌群落根據(jù)管理方式和栽培模式的不同而不同,但是cdna指紋圖譜表明季節(jié)更顯著影響真菌群落。土壤有機(jī)質(zhì)、ec和銨態(tài)氮可以解釋指紋圖譜中觀察到的條帶差異。通過測(cè)序,常規(guī)土壤中的真菌多歸屬于pythiumultimum,alternariaspp.,fusariumoxysporum,sporisoriumreilianum和chaetomiumglobosum,有機(jī)土壤中的真菌多歸屬于cordycepsgunnii,18srdna和18srrna測(cè)序結(jié)果顯示它們之間僅有部分重疊。真菌數(shù)量以及活性的改變都說明了有機(jī)管理方式對(duì)土壤真菌群落產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。由于溫室栽培而引起的真菌群落變化與增加的鹽分有關(guān),其導(dǎo)致了真菌生物量的減少并增加了細(xì)菌的活性。這暗示了有機(jī)管理方中真菌產(chǎn)生的有益影響,可能會(huì)由于溫室栽培而減小。cdna-dgge圖譜可以更加靈敏的觀察到真菌群落的變化,并且是唯一發(fā)現(xiàn)了季節(jié)可產(chǎn)生影響的方法,這說明了在研究中將土壤dna和rna聯(lián)合分析比單獨(dú)以土壤dna為分析對(duì)象可以獲得更高的解析度,并由此發(fā)現(xiàn)真菌群落中沒有被注意到的重要變化。(3)土壤游離氨基酸庫主要由丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸和纈氨酸組成。在土壤游離氨基酸的組分和濃度方面,有機(jī)和常規(guī)土壤沒有顯著差異。然而,堿性氨基酸組氨酸和賴氨酸僅僅存在于有機(jī)土壤,這可能與有機(jī)土壤有更多的土壤交換點(diǎn)有關(guān)。尿素可以顯著的改變游離氨基酸的組分,但僅僅存在于有機(jī)土壤中,說明在有機(jī)土壤里尿素對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)或者是它們的代謝途徑產(chǎn)生了影響。苜蓿和堆肥沒有改變游離氨基酸的組分和濃度。與此相反,培養(yǎng)土壤15天后,秸稈顯著的增加了游離氨基酸的含量,同時(shí)微生物生物量中的氮含量也增加了。在農(nóng)業(yè)土壤中,即使在經(jīng)過長期的有機(jī)管理方式,土壤中的游離氨基酸含量依然很低,并且主要成分穩(wěn)定,但是一些肥料卻能顯著的改變游離氨基酸的組分和含量,而這又影響到氨基酸態(tài)氮在植物吸收利用n素過程中所起到的作用。因此,值得對(duì)影響土壤游離氨基酸組分和含量的控制機(jī)制做進(jìn)一步研究。(4)有機(jī)土壤中微生物生物量和脫氫酶酶活性較高。微生物生物量和脫氫酶酶活性對(duì)所添加肥料的響應(yīng),與肥料的種類以及土壤的管理背景有關(guān)。在有機(jī)土壤中,添加尿素會(huì)減少微生物生物量中的氮含量,但卻在常規(guī)土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加苜蓿僅僅在常規(guī)土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加尿素沒有影響脫氫酶的活性,但是在常規(guī)土壤和有機(jī)土壤中加入苜蓿后都增加了脫氫酶的活性。添加秸稈顯著的增加了微生物生物量氮含量和脫氫酶的活性,但是有機(jī)堆肥對(duì)它們影響不大。有機(jī)和常規(guī)土壤中的細(xì)菌和真菌群落顯著不同。雖然添加秸稈和苜蓿對(duì)真菌和細(xì)菌的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了微小的影響,但是短期的施肥沒有對(duì)微生物的群落產(chǎn)生大的影響。條帶測(cè)序結(jié)果顯示,細(xì)菌和真菌主要?dú)w屬于γ-proteobacteria,firmicutes,acidobacteria和ascomycota。施肥影響土壤化學(xué)和生物特性,然而對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,長期的管理是必須的。研究結(jié)果表明,微生物特性對(duì)短期施肥的響應(yīng)依賴于土壤管理的背景,這些響應(yīng)可能是由土壤背景微生物群落的差異驅(qū)動(dòng)的。(5)結(jié)果表明,有機(jī)土壤比常規(guī)土壤具有更強(qiáng)的潛在固氮能力。在有機(jī)土壤中,苜蓿和堆肥增加了潛在固氮能力,但是在土壤培養(yǎng)中的特殊時(shí)期,尿素和秸稈減小了潛在的固氮能力。與此相反,在常規(guī)土壤中添加苜蓿和尿素對(duì)潛在固氮能力沒有產(chǎn)生顯著的變化。溶解性有機(jī)碳和ph與潛在固氮能力顯著相關(guān)。dgge分析結(jié)果表明,在有機(jī)土壤和常規(guī)土壤中的微生物為簡(jiǎn)單的群落,且兩者之間之間沒有差別,同時(shí)肥料的加入也只有有限的影響,因此,群落結(jié)構(gòu)的不同不能解釋固氮潛力的不同。數(shù)據(jù)表明,固氮能力被種群的規(guī)模和活性驅(qū)動(dòng)而不是由群落結(jié)構(gòu)所驅(qū)動(dòng)。這個(gè)研究說明了,對(duì)于大氣的潛在固氮能力,有機(jī)生產(chǎn)系統(tǒng)要比常規(guī)生產(chǎn)系統(tǒng)強(qiáng),同時(shí)添加苜蓿和有機(jī)堆肥可以顯著增加這種潛力,然而需要進(jìn)一步的研究去量化實(shí)際的固氮量。綜上所述,本文以菜田有機(jī)與常規(guī)栽培土壤為對(duì)象,以大棚和露地栽培為條件,在施用有機(jī)質(zhì)或無機(jī)氮的情況下,系統(tǒng)分析了土壤氮形態(tài)、氨基酸組成、土壤理化性質(zhì)、固氮細(xì)菌區(qū)系和固氮基因nifH的活性、微生物群落構(gòu)成等,發(fā)現(xiàn):有機(jī)條件下SON、總FAA和硝態(tài)氮含量、固氮細(xì)菌的豐度和nif H的活性、真菌多樣性、微生物生物量和脫氫酶活性等均顯著高于常規(guī)土壤。研究了在不同栽培模式(大棚和露地)中,有機(jī)蔬菜生產(chǎn)系統(tǒng)的土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)多樣性;有機(jī)生產(chǎn)系統(tǒng)中有活性的nifH-harboring bacteria的豐度較高,具有固氮潛能,結(jié)果均表明有機(jī)生產(chǎn)土壤具有最大固定大氣N的潛能。發(fā)現(xiàn)了土壤氨基酸在農(nóng)田土壤碳氮循環(huán)和對(duì)植物供氮過程中具有重要作用,肥料顯著影響土壤游離氨基酸濃度和成分,該影響進(jìn)一步說明需要建立植物總氮需求與氨基酸氮吸收之間的聯(lián)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S154.3;S153
，

本文編號(hào)：2370242