本文關鍵詞：番茄根結巨型細胞凋亡相關基因MiPDCD6和LeMYB330的沉默效應研究

  更多相關文章： 南方根結線蟲 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介導的基因沉默)

【摘要】：根結線蟲(Meloidogyne spp.)是一類重要的植物病原線蟲,可以侵染3000多種植物,給農業(yè)生產造成巨大的經濟損失,據估計,全球每年因根結線蟲所造成的損失超過1000億美元。其2齡幼蟲侵人寄主根系,食道腺分泌物經口針注入植物細胞,從而刺激寄主植物根部形成巨型細胞并產生根結。根結線蟲食道腺蛋白在線蟲與寄主植物互作過程中發(fā)揮關鍵作用。在根結線蟲侵染番茄近一個月后,巨型細胞逐漸出現(xiàn)空泡化,內含物大幅度減少,由此推測根結線蟲食道腺分泌蛋白是否啟動了寄主植物的自主凋亡信號轉導途徑。本研究以南方根結線蟲中編碼程序性死亡蛋白6(Programmed cell death protein 6,PDCD6)基因和與之互作的番茄根組織MYB相關蛋白330(Myb-related protein 330-like)基因為研究對象,用RNAi和VIGS技術研究了MiPDCD6基因和LeMYB330基因的功能,為揭示南方根結線蟲調控其寄主巨型細胞空泡化的分子機理和抗根結線蟲育種奠定了良好的基礎。本研究主要取得如下創(chuàng)新性結果:1、揭示了南方根結線蟲Mi PDCD6基因的體外沉默效應,利用RNAi技術,將南方根結線蟲二齡幼蟲浸泡在含有1%間苯二酚,2 mg/mL Mi PDCD6 dsRNA溶液中4h,分別以GFP dsRNA溶液和M9 buffer做為對照。發(fā)現(xiàn)用合成的MiPDCD6和GFP的dsRNA對南方根結線蟲二齡幼蟲進行浸泡處理,在25℃條件下浸泡4h,處理組和對照組的線蟲都處于僵直狀態(tài),用清水使線蟲復蘇4h后,對照組線蟲恢復正常活動,而處理組線蟲出現(xiàn)不規(guī)則扭曲運動和抽搐現(xiàn)象。隨機統(tǒng)計100條發(fā)現(xiàn),處理組與對照組線蟲死亡僵直百分數(shù)存在顯著性差異。半定量RT-PCR檢測結果表明:被dsRNA侵泡后的南方根結線蟲MiPDCD6基因的轉錄水平明顯降低。將處理過的2齡幼蟲接種到空心菜根部28d后,寄主空心菜的根結數(shù)顯著降低46.3%。上述研究結果表明MiPDCD6基因在南方根結線蟲寄生過程中具有重要的調控作用。2、揭示了南方根結線蟲MiPDCD6基因的體內沉默效應,利用VIGS技術,構建pTRV-Mi PDCD6病毒載體,利用農桿菌介導的轉化方法,沉默了南方根結線蟲MiPDCD6基因,并分析了其對番茄根結數(shù)量的影響。接種35d后,pTRV-Mi PDCD6處理的番茄植株中線蟲MiPDCD6表達量顯著下調,沉默處理的番茄植株根結數(shù)比清水處理組減少62.8%,卵囊數(shù)減少60%。結果表明,MiPDCD6基因沉默對根結線蟲病害具有很好的防控效果,也說明MiPDCD6基因可能參與線蟲的寄生過程,并在其中發(fā)揮重要的調控作用。3、揭示了番茄LeMYB330基因的沉默效應,利用VIGS技術,構建pTRV-LeMYB330病毒載體,利用農桿菌介導的轉化方法,沉默了番茄LeMYB330基因,并分析了其對番茄根結數(shù)量的影響。接種35d后,pTRV-LeMYB330處理的番茄植株中LeMYB330基因表達量顯著下調,沉默處理的番茄植株根結數(shù)比清水處理組增多6.9%,卵囊數(shù)增多15.3%,但未達到顯著水平。結果表明,LeMYB330基因沉默可能降低了番茄對根結線蟲的抗性,更加有利于根結線蟲的侵染。
【關鍵詞】：南方根結線蟲 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介導的基因沉默)
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.412
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞及英漢對照7-12
• 1 前言12-23
• 1.1 根結線蟲病的發(fā)生與防治概況12-14
• 1.2 RNAi及其在基因功能研究中的應用14-16
• 1.2.1 RNAi的機制15
• 1.2.2 RNAi技術在防治植物寄生線蟲上的應用15-16
• 1.3 VIGS技術及其在基因功能研究中的應用16-18
• 1.3.1 VIGS的定義及原理16-17
• 1.3.2 VIGS技術在基因功能研究中的應用17-18
• 1.4 PDCD6基因功能研究進展18-19
• 1.5 MYB基因功能研究進展19-21
• 1.6 研究目的和意義21-23
• 2 材料與方法23-44
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 實驗材料23
• 2.1.2 供試植物23
• 2.1.3 菌株及質粒載體23
• 2.1.4 供試試劑及配制23-24
• 2.1.5 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.6 電泳25
• 2.1.7 提取RNA的實驗用品及試劑25
• 2.1.8 常用儀器設備25-26
• 2.2 方法26-44
• 2.2.1 植物材料培養(yǎng)26
• 2.2.2 線蟲接種26
• 2.2.3 侵染前二齡幼蟲的收集26
• 2.2.4 MiPDCD6基因的體外RNAi26-31
• 2.2.5 半定量RT-PCR檢測干涉效果31-34
• 2.2.6 南方根結線蟲MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效應34-44
• 3 結果與分析44-58
• 3.1 MiPDCD6基因的體外RNAi效應44-49
• 3.1.1 MiPDCD6基因和外源基因GFP體外轉錄模板的制備44
• 3.1.2 MiPDCD6基因和外源基因GFP的dsRNA合成44-45
• 3.1.3 MiPDCD6和GFP體外RNAi對線蟲活力的影響45-46
• 3.1.4 MiPDCD6和GFP體外RNAi對南方根結線蟲侵染力的影響46-47
• 3.1.5 半定量RT-RCR檢測dsRNA浸泡對MiPDCD6表達量的影響47-49
• 3.2 南方根結線蟲MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效應49-58
• 3.2.1 目的基因片段的克隆與鑒定49-52
• 3.2.2 VIGS載體的構建與鑒定52-54
• 3.2.3 VIGS結果與檢測54-58
• 4 結論與討論58-64
• 4.1 結論58
• 4.2 討論58-64
• 4.2.1 南方根結線蟲MiPDCD6基因體外RNAi58-60
• 4.2.2 南方根結線蟲MiPDCD6基因VIGS效應分析60
• 4.2.3 番茄LeMYB330基因的VIGS效應分析60-61
• 4.2.4 影響VIGS的因素61-64
• 致謝64-65
• 參考文獻65-71
• 附錄71-72

【參考文獻】

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本文編號：898889