本文關鍵詞：轉(zhuǎn)IRT1基因龍葵毛狀根體系的建立及其對鎘脅迫響應的初步探討

  更多相關文章： 鎘超富集植物 龍葵 毛狀根 發(fā)根農(nóng)桿菌 IRT1 發(fā)根農(nóng)桿菌 芥菜 油菜

【摘要】：目的：自然界中存在能夠富集鎘(Cd)的超富集植物,這種植物可以通過新陳代謝機制攝取和固定環(huán)境中的Cd,從而在一定限度的Cd污染環(huán)境中得以生存。但目前已知的Cd超富集植物普遍存在富集量有限和富集系數(shù)低等缺點,影響了推廣和應用。隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展,通過基因工程的手段對Cd超富集植物進行基因改造,是實現(xiàn)Cd污染環(huán)境植物修復實際應用的有效方法。本研究選擇了分布廣泛、易獲得的Cd超富集植物龍葵(Solanum nigrum L.)進行轉(zhuǎn)基因改造研究,利用農(nóng)桿菌介導的方法建立轉(zhuǎn)IRT1基因的龍葵毛狀根體系,對轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根富集Cd的效果和可能的機制進行探討,希望為轉(zhuǎn)IRT1龍葵植株的再生和應用提供可靠的理論基礎。方法：論文首先選取龍葵、油菜、芥菜3種Cd超富集植物進行毛狀根的誘導,通過對3種植物毛狀根組織富集Cd的能力和機制的初步研究,確定進行轉(zhuǎn)基因改造的目標植物為龍葵。然后對龍葵毛狀根的誘導條件進行進一步的優(yōu)化,考查不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌種、預培養(yǎng)時激素萘乙酸(NAA)濃度、不同的外植體來源、不同的外植體類型對龍葵毛狀根誘導的影響。在對龍葵毛狀根誘導條件進行優(yōu)化的基礎上,利用Takara公司的pRll0.7質(zhì)粒將與Cd富集相關的IRT1基因整合進入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834中,并利用改造過的轉(zhuǎn)IRT1-ATCC15834菌液侵染龍葵葉片外植體,誘導獲得轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根。建立起穩(wěn)定的轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系后,利用PCR技術進行IRT1基因、rolB基因的檢驗,確定IRT1基因、rolB基因已經(jīng)整合到植物毛狀根組織的DNA中；利用Western blot技術進行目的蛋白的檢驗,確定IRT1基因的蛋白表達情況。最后對轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根進行Cd富集實驗研究。將轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根分別置于含不同濃度Cd的培養(yǎng)液中進行暗培養(yǎng)。14 d后取樣進行毛狀根生長狀態(tài)、生物量、Cd含量、ROS(活性氧,Reactive Oxygen Species)積累情況、細胞凋亡情況、抗氧化酶系統(tǒng)活性、IRT1蛋白表達情況的分析和比較,探討轉(zhuǎn)入IRT1基因?qū)μ岣啐埧珷罡褪蹸d能力的影響。結(jié)果：根據(jù)龍葵、油菜和芥菜三種植物的毛狀根誘導生根率、毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系建立后毛狀根的生長狀況、毛狀根組織富集Cd能力的比較,發(fā)現(xiàn)龍葵毛狀根生物量大、富集Cd的能力較好,在Cd濃度為100μmol/L的條件下培養(yǎng)14 d后鮮重可達2.897 g,毛狀根中的Cd含量可達745.023μg/g,是適合用于進一步進行轉(zhuǎn)基因改造的目標植物。對龍葵毛狀根誘導條件優(yōu)化的結(jié)果表明,利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染生長3周的龍葵無菌苗外植體葉片(預培養(yǎng)NAA濃度為0.6mg/L),毛狀根的誘導效果最好,此條件下生根率達90%以上。利用含IRT1基因的重組菌ATCC15834侵染龍葵葉片外植體獲得了轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根,rol B、IRT1基因的PCR檢測結(jié)果表明毛狀根DNA中存在423 bp、1044bp大小條帶,證明rol B基因、IRT1基因已經(jīng)整合進入龍葵毛狀根組織。Western blot技術檢驗發(fā)現(xiàn)IRT1基因目的蛋白已有表達。Cd脅迫實驗結(jié)果表明,在無Cd處理的對照條件下,轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根與未轉(zhuǎn)入IRTl的野生型龍葵毛狀根在各方面評價指標中均無明顯差異；隨著培養(yǎng)液中Cd濃度的升高,野生型和轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根都能有效地耐受高濃度Cd的脅迫作用,但轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根的耐受能力優(yōu)于野生龍葵毛狀根。在不同Cd濃度下,轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根相比,褐化程度都較小,生長狀態(tài)更好。在含100 μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d后,與未經(jīng)Cd處理的對照組毛狀根相比,野生型龍葵毛狀根鮮重減少了26.2%,干重減少了18.0%；而轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根在含100μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d后,與未經(jīng)Cd處理的轉(zhuǎn)IRTl龍葵毛狀根相比鮮重僅減少了6.0%,干重減少了2.5%,對比可知,轉(zhuǎn)入IRTl基因的龍葵毛狀根生物量受Cd毒害作用的影響較小。從Cd的富集量來看,在Cd濃度為100gmol/L的條件下,轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和野生型龍葵毛狀根中Cd的富集量分別為886.759 gg/g和745.023μg/g,表明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根表現(xiàn)出更優(yōu)的Cd富集效果。并且在Cd脅迫下,轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根的抗氧化酶活性(CAT、SOD、POD)更強,IRT1蛋白表達量高；而ROS積累程度和細胞凋亡程度比野生型毛狀根小,說明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根細胞受損傷的程度小。上述結(jié)果表明IRT1基因的轉(zhuǎn)入較好地提高了龍葵毛狀根對Cd的耐受能力,實現(xiàn)了對龍葵毛狀根的轉(zhuǎn)基因改造目標。論文建立的轉(zhuǎn)基因自主生長毛狀根體系可作為重金屬吸附機理研究的可靠實驗體系,研究結(jié)果為將來獲得轉(zhuǎn)IRT1基因龍葵再生植株提供了一定的應用理論基礎。
【關鍵詞】：鎘超富集植物 龍葵 毛狀根 發(fā)根農(nóng)桿菌 IRT1 發(fā)根農(nóng)桿菌 芥菜 油菜
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q945.78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 1 引言14-20
• 1.1 重金屬鎘(Cd)超富集植物研究現(xiàn)狀14-15
• 1.1.1 重金屬Cd污染土壤修復研究的進展14
• 1.1.2 現(xiàn)有重金屬Cd超富集植物開發(fā)及研究現(xiàn)狀14-15
• 1.1.3 龍葵應用于Cd污染土壤修復的優(yōu)勢15
• 1.2 重金屬Cd超富集植物的轉(zhuǎn)基因改造進展15-17
• 1.2.1 植物富集Cd的分子機制16
• 1.2.2 重金屬Cd超富集植物轉(zhuǎn)基因改造現(xiàn)狀16-17
• 1.3 毛狀根組織在植物修復研究中的應用17-19
• 1.3.1 重金屬超富集植物的轉(zhuǎn)基因改造研究方法17-18
• 1.3.2 毛狀根的特性及應用于植物修復中的優(yōu)勢18-19
• 1.4 本實驗的研究目的和意義19-20
• 1.4.1 目的19
• 1.4.2 意義19-20
• 2 實驗材料和方法20-43
• 2.1 實驗材料20-24
• 2.1.1 生物材料20
• 2.1.2 試劑、耗材、主要儀器20-22
• 2.1.2.1 試劑及儀器采購廠家20-21
• 2.1.2.2 儀器信息21-22
• 2.1.3 試劑的配制22-24
• 2.1.3.1 培養(yǎng)基的配制22-23
• 2.1.3.2 緩沖液的配制23-24
• 2.1.3.3 抗生素的配制24
• 2.2 實驗方法24-43
• 2.2.1 菌種的活化及保存24-26
• 2.2.2 Cd超富集植物毛狀根誘導的摸索及目標Cd超富集植物的選擇26
• 2.2.3 毛狀根的誘導26-27
• 2.2.4 毛狀根誘導條件的優(yōu)化實驗設計27-28
• 2.2.5 毛狀根基因組的提取和PCR檢測28-29
• 2.2.6 三種植物Cd富集實驗設計29-33
• 2.2.7 龍葵毛狀根生長曲線的測定33
• 2.2.8 IRT1編碼基因的合成33-34
• 2.2.9 重組質(zhì)粒pRI101-IRT1的獲得34-37
• 2.2.10 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌的獲得和菌種保藏37-38
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌的PCR檢測38
• 2.2.12 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根的獲得及鑒定38
• 2.2.13 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根總蛋白的提取和Western blot檢測分析38-41
• 2.2.14 龍葵毛狀根Cd脅迫響應實驗設計41-42
• 2.2.15 數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計學分析42-43
• 3 實驗結(jié)果與討論43-72
• 3.1 三種Cd超富集植物毛狀根誘導的比較及轉(zhuǎn)基因改造目標植物龍葵的確定43-58
• 3.1.1 發(fā)根農(nóng)桿菌菌種對不同植物外植體生根誘導的影響43-45
• 3.1.2 三種Cd超富集植物毛狀根的PCR檢驗及rolB基因鑒定45-46
• 3.1.3 最佳誘導條件下三種Cd超富集植物生根效果的比較46
• 3.1.4 三種Cd超富集植物毛狀根富集Cd能力的分析46-54
• 3.1.4.1 Cd處理后三種植物毛狀根生長狀態(tài)的比較46-48
• 3.1.4.2 Cd處理后三種植物毛狀根生物量的比較48-49
• 3.1.4.3 三種植物毛狀根富集Cd含量的比較49
• 3.1.4.4 Cd處理對三種植物毛狀根細胞損傷程度的比較49-51
• 3.1.4.5 Cd處理對三種植物毛狀根抗氧化還原酶系統(tǒng)活性的變化比較51-54
• 3.1.5. 轉(zhuǎn)基因改造目標植物龍葵的確定54
• 3.1.6 轉(zhuǎn)基因改造目標植物龍葵毛狀根誘導條件的進一步優(yōu)化54-57
• 3.1.6.1 不同激素濃度對不同的龍葵外植體生根誘導的影響54-55
• 3.1.6.2 不同來源的材料誘導龍葵毛狀根的差異55-56
• 3.1.6.3 龍葵毛狀根液體培養(yǎng)體系的建立56-57
• 3.1.7 龍葵毛狀根生長曲線的測定57-58
• 3.1.8 小結(jié)58
• 3.2 pRI101-IRT1載體的構建及轉(zhuǎn)IRE1龍葵毛狀根體系的建立58-62
• 3.2.1 質(zhì)粒pUC57、pRI101的雙酶切鑒定58
• 3.2.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化結(jié)果分析58-60
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌中IRT1基因的PCR鑒定60
• 3.2.4 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根的形態(tài)比較60
• 3.2.5 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根DNA中IRT1基因的PCR結(jié)果60-62
• 3.2.6 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根DNA的測序結(jié)果62
• 3.2.7 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根目的蛋白表達結(jié)果62
• 3.2.8 小結(jié)62
• 3.3 轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根對Cd脅迫響應的初步探討62-72
• 3.3.1 Cd處理下轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根生長狀況的對比62-64
• 3.3.2 Cd處理對轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組龍葵毛狀根生物量的影響64-65
• 3.3.3 轉(zhuǎn)IRT1-龍葵毛狀根和對照組毛狀根富集Cd效果的比較65
• 3.3.4 Cd處理下轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根中ROS的積累和細胞損傷程度的比較65-68
• 3.3.5 Cd處理對轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和對照組毛狀根抗氧化還原酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)活性的變化比較68-70
• 3.3.6 Cd處理對轉(zhuǎn)基因龍葵毛狀根中IRT1蛋白表達的分析和比較70-71
• 3.3.7 小結(jié)71-72
• 4 結(jié)論72-74
• 參考文獻74-78
• 作者簡歷及攻讀碩士學位期間取得的研究成果78-80
• 學位論文數(shù)據(jù)集80

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