目的:在全世界范圍內,胃癌發(fā)病率占惡性腫瘤總發(fā)病率的第4位,而死亡率卻排在第3位的常見的惡性腫瘤之一。我國是胃癌大國,東南沿海地區(qū)是胃癌的高發(fā)地區(qū)。所以胃癌是嚴重影響我國國民健康的重大疾病。由于缺乏特異性癥狀,臨床上很難早期發(fā)現,臨床Ⅲ期、Ⅳ期患者占大多數。目前胃癌內科治療手段有限,能進行根治性手術的患者比例小,化療療效欠佳,靶向治療也只有曲妥珠單抗和阿帕替尼取得了肯定的臨床療效,但適用人群有限,還存在著治療耐藥問題。當今腫瘤治療已進入精準醫(yī)療時代,需要找到新的治療靶點,開發(fā)新的治療藥物。ROS1是一種是單體型受體酪氨酸激酶,廣泛表達于人體腎、小腦、胃腸等多種組織。目前的研究發(fā)現在肺癌、卵巢癌、肉瘤、膽管細胞癌和炎性肌纖維母細胞瘤等組織中以基因重排方式激活,是一種癌基因。近年在非小細胞肺癌的臨床研究中找到了針對ROS1基因重排的治療藥物克唑替尼。使這一基因成為惡性腫瘤精準治療研究的重要靶點。已有國內外學者在胃癌臨床組織標本中用FISH方法檢測到ROS1基因重排,且確定ROS1基因重排與差的臨床表型如低分化、淋巴結轉移相關。因此雖然ROS1基因重排在胃癌中檢出率不高,但已經開發(fā)出確定有效的...

【文章頁數】：135 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :ROS1基因穩(wěn)定沉默胃癌細胞株的建立
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗細胞
            2.1.2 質粒
            2.1.3 PCR引物
            2.1.4 主要實驗儀器
            2.1.5 主要實驗試劑
            2.1.6 主要溶液的配置
        2.2 實驗方法
            2.2.1 胃癌細胞培養(yǎng)
            2.2.2 RNA干擾質粒的構建
            2.2.3 ROS1 基因穩(wěn)定沉默胃癌細胞的篩選和培養(yǎng)
            2.2.4 Western blot鑒定胃癌細胞ROS1 蛋白的表達
            2.2.5 Real-time PCR方法鑒定ROS1 基因敲減效率
        2.3 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 ROS1 基因在胃癌細胞中的蛋白表達
        3.2 成功建立ROS1 基因穩(wěn)定沉默的胃癌細胞株
            3.2.1 質粒構建及測序驗證
            3.2.2 ROS1 基因穩(wěn)定沉默胃癌細胞株的建立
        3.3 ROS1 基因敲減效率測定
            3.3.1 應用Real-time PCR方法檢測ROS1 基因敲減后胃癌細胞ROS1 mRNA表達減低
            3.3.2 應用Western Blot方法檢測ROS1 基因敲減后胃癌細胞ROS1 蛋白表達降低
    4 討論
    5 結論
第二部分 :ROS1基因對胃癌細胞生物學行為的影響
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 胃癌細胞
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 主要溶液配制
        2.2 實驗方法
            2.2.1 MTT法測定各組細胞生長曲線
            2.2.2 克隆形成實驗檢測胃癌細胞成瘤能力
            2.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期
            2.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡
            2.2.5 細胞劃痕愈合實驗檢測胃癌細胞遷移能力
            2.2.6 Transwell小室侵襲實驗觀察胃癌細胞侵襲能力
        2.3 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌細胞生長速度減慢
        3.2 ROS1 基因沉默后胃癌細胞克隆形成數量減少
        3.3 ROS1 基因沉默后細胞周期G1 期比例升高,S/G2 期比例下降
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌細胞凋亡比例增高
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌細胞劃痕愈合率減慢
        3.6 ROS1 基因沉默后胃癌細胞穿過小室微孔膜數量減少
    4 討論
    5 結論
第三部分 :ROS1基因影響胃癌細胞生物學行為的分子機制
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 胃癌細胞株
            2.1.2 PCR引物
            2.1.3 主要實驗儀器
            2.1.4 主要試劑
            2.1.5 主要溶液配制
        2.2 實驗方法
            2.2.1 Western blot方法檢測各組胃癌細胞中凋亡相關蛋白
            2.2.2 Western blot方法檢測細胞粘附蛋白及細胞骨架蛋白表達
            2.2.3 Western blot方法檢測胃癌細胞中信號傳導通路蛋白表達
            2.2.4 Real-time PCR方法檢測胃癌細胞調控上皮間質轉化相關轉錄因子
            2.2.5 Real-time PCR方法檢測胃癌細胞轉移相關基因MMP9 表達情況
        2.3 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌細胞凋亡相關因子變化
        3.2 ROS1 基因沉默后細胞粘附蛋白及細胞骨架蛋白的變化
        3.3 ROS1 基因沉默后胃癌細胞信號傳導通路蛋白變化
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌細胞上皮間質轉化相關轉錄因子Twist,Snail,Slug表達下降
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌細胞MMP9 基因表達下降
    4 討論
    5 結論
第四部分 :ROS1在胃癌組織中過表達且與胃癌不良預后相關
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 TCGA數據庫中胃癌組織中ROS1 mRNA的表達與臨床病理因素及患者預后的關系以及ROS1 基因擴增情況
            2.1.2 組織標本
            2.1.3 主要儀器
            2.1.4 主要試劑
            2.1.5 主要試劑溶液配置
        2.2 實驗方法
            2.2.1 qRT-PCR法檢測ROS1 mRNA在37 例胃癌及其配對正常胃粘膜組織中的表達
            2.2.2 免疫組織化學染色檢測胃癌組織中ROS1 蛋白表達
    3 結果
        3.1 TCGA數據庫ROS1 mRNA在胃癌組織中高表達
        3.2 TCGA數據庫ROS1 mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系及意義
        3.3 ROS1 mRNA表達與胃癌總生存率的關系
        3.4 TCGA數據中ROS1 基因擴增
        3.5 qRT-PCR方法檢測ROS1 mRNA在37 例胃癌組織中高表達
        3.6 免疫組織化學染色檢測ROS1 蛋白在胃癌及正常胃粘膜組織中的表達
    4 討論
    5 結論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：4044798