檸檬酸是一種重要的多功能有機(jī)酸,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。我國(guó)是檸檬酸生產(chǎn)大國(guó),檸檬酸產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%。但在檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中,發(fā)酵液殘?zhí)呛?%左右,造成原料的極大浪費(fèi)。分析發(fā)酵液殘?zhí)浅煞挚芍?其中約69%都是異麥芽糖,還有約23%為α-呋喃型葡萄糖苷,而這些非發(fā)酵性的糖主要是由α-葡萄糖苷酶的催化形成的。因此,檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中決定殘?zhí)切纬傻年P(guān)鍵酶之一是α-葡萄糖苷酶。本研究通過(guò)分析產(chǎn)檸檬酸黑曲霉基因組序列,分析其中可能的α-葡萄糖苷酶基因并進(jìn)行基因敲除,降低殘?zhí)呛?提高糖類(lèi)的利用率和檸檬酸的產(chǎn)量。具體展開(kāi)以下研究工作:1.運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化產(chǎn)檸檬酸黑曲霉,分別敲除了α-葡萄糖苷酶A基因及假定-α-葡萄糖苷酶基因-40261,得到敲除突變株KO-214233及KO-40261。2.研究?jī)蓚�(gè)基因敲除菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)現(xiàn),兩株敲除菌株與野生型菌株相比菌落形態(tài)、孢子形態(tài)和菌體生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化,但菌絲球形態(tài)與大小發(fā)生改變。敲除突變株KO-214233相比敲除突變株KO-40261及野生型菌株的菌絲球邊緣更為光滑;敲除突變株KO-214233菌絲球周長(zhǎng)最小,敲除突變株...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－２?ｐＰＺＰ骨架和ＨＹＧ片段回收的掠脂糖電泳陽(yáng)??

因左、右同源臂并連接至Ｔ載體，得到重組質(zhì)粒２１４２３３Ｌ－Ｔ和２１４２３３Ｒ－Ｔ。然??后用／／ｈｄｌＩＩ和兮ｅｌ酶ｔ刀重組質(zhì)粒２１４２３３Ｌ－Ｔ，用和印《丨酶切重組質(zhì)粒??２１４２３３Ｒ－Ｔ，膠回收目的基因。結(jié)果如圖３－１所示。??Ｍ?１?２??ｂｐ＿：＿；??腦??３０００?....

圖３－丨２１４２３３Ｌ－Ｔ、２１４２３３Ｒ－Ｔ膠回收瓊脂糖電泳圖??

因左、右同源臂并連接至Ｔ載體，得到重組質(zhì)粒２１４２３３Ｌ－Ｔ和２１４２３３Ｒ－Ｔ。然??后用／／ｈｄｌＩＩ和兮ｅｌ酶ｔ刀重組質(zhì)粒２１４２３３Ｌ－Ｔ，用和印《丨酶切重組質(zhì)粒??２１４２３３Ｒ－Ｔ，膠回收目的基因。結(jié)果如圖３－１所示。??Ｍ?１?２??ｂｐ＿：＿；??腦??３０００?....

圖3-3敲除載體pPZP-214233的構(gòu)建

?３結(jié)果與討論???如上圖所示，膠回收片段與理論值大小一致，且回收亮度較好。??３．１．３敲除載體ｐＰＺＰ－２１４２３３的構(gòu)建??將上述切膠回收得到的四個(gè)片段按２．２．３．６?（２）方法進(jìn)行１６°Ｃ過(guò)夜連接，然??后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＪＭ１０９感受態(tài)，經(jīng)Ｋａｎａ抗性平板篩選，挑取單克隆....

圖３－４重組質(zhì)粒ｐＰＺＰ－２１４２３３酶切驗(yàn)證??

將上述切膠回收得到的四個(gè)片段按２．２．３．６?（２）方法進(jìn)行１６°Ｃ過(guò)夜連接，然??后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＪＭ１０９感受態(tài)，經(jīng)Ｋａｎａ抗性平板篩選，挑取單克隆抗體進(jìn)行??提質(zhì)粒。敲除載體ｐＰＺＰ－２１４２３３構(gòu)建如圖３－３所示。??Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ?ＤＮＡ?ｏｆ?Ａ．ｎｉｇｅｒ??＼....

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