丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)體內(nèi)水溶性酚酸類物質(zhì)具有顯著的藥理活性并已成為目前研究熱點。植物體內(nèi)microRNAs(miRNAs)作為一類非編碼小分子RNA,廣泛參與生長、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及環(huán)境脅迫的調(diào)控,但miRNAs參與植物體內(nèi)次生代謝調(diào)控研究的報道較少。本研究前期通過Small RNA高通量測序獲得的1條丹參miR858(命名為Sm-miR858)序列為基礎(chǔ),通過over-lapping PCR技術(shù)構(gòu)建了人工Sm-miR858前體(aSm-miR858)植物過表達載體(35S:aSm-miR858),并對丹參進行轉(zhuǎn)化,以分析丹參體內(nèi)Sm-miR858過表達后對酚酸類活性成分合成的影響,進而探索Sm-miR858在丹參體內(nèi)的生物學(xué)功能。實時定量PCR和RNA印跡結(jié)果顯示,在各陽性轉(zhuǎn)基因株系中,Sm-miR858均呈現(xiàn)不同程度過表達。同時,Sm-miR858的潛在靶標(biāo)基因Sm-PAP1表達水平呈現(xiàn)相應(yīng)不同程度的顯著下調(diào),且轉(zhuǎn)化株系中酚酸類活性成分含量均低于同期的野生型丹參。進一步檢測上述各丹參植株中酚酸類活性成分代謝途徑相關(guān)酶基因表達水平。結(jié)果顯示,酚酸類...

【文章頁數(shù)】：10 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 35S:Sm-miR858植物表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化
    1.3 DNA提取及轉(zhuǎn)基因丹參組培苗的基因組分子檢測
    1.4 RNA提取及cDNA的合成
    1.5 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測基因的表達水平
    1.6 Southern印跡、Northern印跡和Small RNA Northern印跡檢測
        (1)Southern 印跡操作方法:
        (2)Northern 印跡操作方法:
        (3)Small RNA Northern 印跡操作方法:
    1.7 不同株系丹參體內(nèi)黃酮類及酚酸類物質(zhì)含量的測定
    1.8 統(tǒng)計學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 Sm-miR858人工前體序列再生植物體內(nèi)整合性驗證結(jié)果
    2.2 轉(zhuǎn)基因丹參株系中Sm-miR858與SmPAP1的表達水平呈負(fù)相關(guān)
    2.3 Sm-miR858過表達轉(zhuǎn)基因丹參株系中酚酸類物質(zhì)含量呈顯著下降
    2.4 Sm-miR858的過表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因丹參植株中酚酸類代謝途徑中相關(guān)酶基因表達水平下降
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