肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關(guān)致死的主要原因之一。在檢出的肺癌患者中,有80%-85%為非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC),且其中大部分病例在確診時(shí)已是中晚期,五年生存率僅為10%-15%。NSCLC的傳統(tǒng)治療包括手術(shù)、化療和放療等手段,但隨著近年來研究者對(duì)NSCLC研究的不斷深入以及精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展,依據(jù)患者的遺傳信息以制定個(gè)體化治療方案在NSCLC治療中的作用日益凸顯。目前,已有一系列NSCLC靶向治療相關(guān)的基因突變和基因重排分子檢測在臨床上得以廣泛應(yīng)用。其中人類棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣 4(Echinoderm microtubule-associated protein like 4,EML4 基因和人類間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排形成的融合基因,即EML4-ALK融合基因檢測即被證明可用于指導(dǎo)NSCLC患者進(jìn)行克唑替尼靶向治療。目前,EML4-ALK融合基因的常用檢測方法有免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)、熒光原位雜交(Fl...

【文章頁數(shù)】：184 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
英文縮略詞
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英文摘要
前言
1. 材料和方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑配制
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.1.4 溶液配制
        1.1.5 細(xì)胞系
        1.1.6 菌株及載體
        1.1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)
            1.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            1.2.1.2 細(xì)胞換液
            1.2.1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及傳代
            1.2.1.4 細(xì)胞凍存
        1.2.2 HEK293T細(xì)胞系EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗(yàn)證
            1.2.2.1 HEK293T、H3122及H2228細(xì)胞總RNA提取
            1.2.2.2 RT-qPCR方法驗(yàn)證HEK293T細(xì)胞EML4-ALK融合基因狀態(tài)
        1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系
            1.2.3.1 靶位點(diǎn)選擇及sgRNA設(shè)計(jì)
            1.2.3.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
            1.2.3.3 攜帶不同sgRNA的CRISPR/Cas9表達(dá)載體篩選
            1.2.3.4 EML4-ALK融合基因陽性混合克隆制備及驗(yàn)證
            1.2.3.5 EML4-ALK融合基因陽性單克隆細(xì)胞篩選
        1.2.4 基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系驗(yàn)證
            1.2.4.1 DNA水平驗(yàn)證
            1.2.4.2 RNA水平驗(yàn)證
            1.2.4.3 蛋白水平驗(yàn)證
        1.2.5 攜帶相關(guān)EML4-ALK融合基因的異種移植動(dòng)物模型建立
            1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備
            1.2.5.2 接種細(xì)胞懸液制備
            1.2.5.3 動(dòng)物接種
            1.2.5.4 異種移植成瘤觀察及動(dòng)物處死
        1.2.6 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備及驗(yàn)證
            1.2.6.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備
            1.2.6.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)IHC方法驗(yàn)證
            1.2.6.3 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)FISH方法驗(yàn)證
            1.2.6.4 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)RT-qPCR方法驗(yàn)證
            1.2.6.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)NGS方法驗(yàn)證
        1.2.7 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性及穩(wěn)定性探究
            1.2.7.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性研究
            1.2.7.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)穩(wěn)定性研究
2. 結(jié)果
    2.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)及EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗(yàn)證
        2.1.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)
        2.1.2 HEK293T細(xì)胞系EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗(yàn)證
    2.2 CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系
        2.2.1 EML4-ALK融合基因靶向sgRNA設(shè)計(jì)
        2.2.2 pX330載體驗(yàn)證
        2.2.3 pX330-sgRNA重組質(zhì)粒載體驗(yàn)證
        2.2.4 pX330-sgRNA重組質(zhì)粒載體篩選
        2.2.5 混合克隆制備及驗(yàn)證
        2.2.6 單克隆細(xì)胞篩選
    2.3 新型EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系驗(yàn)證
        2.3.1 DNA水平驗(yàn)證
        2.3.2 RNA水平驗(yàn)證
        2.3.3 蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證
    2.4 異種移植動(dòng)物模型建立
    2.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備及驗(yàn)證
        2.5.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備
        2.5.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)IHC方法驗(yàn)證
        2.5.3 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)FISH方法驗(yàn)證
        2.5.4 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)RT-qPCR方法驗(yàn)證
        2.5.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)NGS方法驗(yàn)證
    2.6 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性及穩(wěn)定性探究
        2.6.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性驗(yàn)證
        2.6.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)穩(wěn)定性驗(yàn)證
3. 討論
參考文獻(xiàn)
論文綜述
    References
附錄
    附錄1 PX330載體信息
        1. pX330載體結(jié)構(gòu)
        2. pX330載體位點(diǎn)
        3. pX330載體序列
    附錄2 PEGFP-1載體信息
        1. pEGFP-1載體結(jié)構(gòu)
        2. pEGFP-1載體位點(diǎn)
        3. pEGFP-1載體序列
    附錄3 PMD18-T載體信息
        1. pMD18-T載體結(jié)構(gòu)
        2. pMD18-T載體位點(diǎn)
        3. pMD18-T載體序列
    附錄4 EML4-ALK融合基因V1型、V2型及V3型MRNA序列信息
        1. EML4-ALK融合基因V1型mRNA序列信息
        2. EML4-ALK融合基因V2型mRNA序列信息
        3. EML4-ALK融合基因V3a型mRNA序列信息
        4. EML4-ALK融合基因V3b型mRNA序列信息
    附錄5 EML4基因及ALK基因MRNA序列信息
        1. EML4基因mRNA序列信息
        2. ALK基因mRNA序列信息
    附錄6 EML4基因INTRON 13/INTRON 20/INTRON 6及ALK基因INTRON 19序列信息
        1. EML4基因intron 13序列信息
        2. EML4基因intron 20序列信息
        3. EML4基因intron 6序列信息
        4. ALK基因intron 19序列信息
致謝
個(gè)人簡介



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