目的研究miR-148a及HK2基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞糖酵解代謝途徑的影響和可能機(jī)制。方法熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)miR-148a在乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231)中的表達(dá)情況;ELISA法檢測(cè)葡萄糖的攝取量、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)乳酸的生成量,BrdU法檢測(cè)增殖情況,Western免疫印跡法檢測(cè)HK2蛋白水平的變化。通過(guò)TargetScan對(duì)miR-148a與HK2的作用位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-148a與HK2的靶向關(guān)系。然后采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HK2基因,觀察該細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取、乳酸生成以及增殖情況。結(jié)果miR-148a在MDA-MB231中表達(dá)量顯著降低(P<0.01);過(guò)表達(dá)miR-148a使MDA-MB231細(xì)胞的葡萄糖攝取量下降1.8倍(P<0.01)、乳酸生成量下降2.4倍(P<0.01),細(xì)胞增殖指標(biāo)下降2.2倍(P<0.01);抑制miR-148a表達(dá),MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量上升1.6倍(P<0.01),乳酸生成量上升1.7倍(P<0...

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第1章 miR-148a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)基因HK2對(duì)乳腺癌細(xì)胞糖酵解代謝的影響
    1.1 材料與方法
        1.1.1 細(xì)胞系
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器
        1.1.4 細(xì)胞的復(fù)蘇
        1.1.5 細(xì)胞的培養(yǎng)
        1.1.6 細(xì)胞的傳代
        1.1.7 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        1.1.8 細(xì)胞中總RNA的提取
        1.1.9 cDNA的制備
        1.1.10 HK2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建
        1.1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        1.1.12 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中葡萄糖攝取量的檢測(cè)
        1.1.13 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中乳酸水平的檢測(cè)
        1.1.14 蛋白樣品的提取
        1.1.15 蛋白濃度的測(cè)定
        1.1.16 免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)HK2蛋白的表達(dá)水平
        1.1.17 BrdU法檢測(cè)細(xì)胞的增殖
        1.1.18 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        1.1.19 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 miR-148a在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況
        1.2.2 過(guò)表達(dá)miR-148a對(duì)MDA-MB231細(xì)胞的影響
        1.2.3 抑制miR-148a對(duì)MDA-MB231細(xì)胞的影響
        1.2.4 驗(yàn)證miR-148a與HK2基因的靶向關(guān)系
        1.2.5 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過(guò)表達(dá)所致促葡萄糖攝取效應(yīng)
        1.2.6 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過(guò)表達(dá)所致促乳酸生成效應(yīng)
        1.2.7 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過(guò)表達(dá)所致促細(xì)胞增殖效應(yīng)
    1.3 討論
        1.3.1 miR-148a在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況
        1.3.2 miR-148a對(duì)MDA-MB231細(xì)胞糖代謝和細(xì)胞增殖的影響
        1.3.3 miR-148a與HK2基因存在靶向關(guān)系
        1.3.4 miR-148a靶向抑制HK2逆轉(zhuǎn)由HK2過(guò)表達(dá)所致促糖酵解和細(xì)胞增殖效應(yīng)
    1.4 小結(jié)
第2章 HK2基因缺陷型乳腺癌細(xì)胞MCF-7中糖酵解代謝的變化
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器
        2.1.4 細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代
        2.1.5 HK2雙基因敲除載體的構(gòu)建
        2.1.6 HK2基因敲除載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        2.1.7 HK2基因缺陷細(xì)胞篩選與測(cè)序分析
        2.1.8 HK2基因缺陷型MCF-7細(xì)胞葡萄糖攝取量檢測(cè)
        2.1.9 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中乳酸水平的檢測(cè)
        2.1.10 BrdU法檢測(cè)細(xì)胞的增殖
        2.1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況鑒定
        2.2.2 基因敲除細(xì)胞株的鑒定
        2.2.3 HK2基因缺陷對(duì)MCF-7細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
        2.2.4 HK2基因缺陷對(duì)MCF-7細(xì)胞乳酸生成的影響
        2.2.5 HK2基因缺陷對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖變化
    2.3 討論
        2.3.1 HK2基因敲除載體的構(gòu)建
        2.3.2 HK2基因敲除細(xì)胞的獲得與鑒定
        2.3.3 HK2基因缺陷對(duì)MCF-7細(xì)胞糖酵解和細(xì)胞增殖能力的影響
    2.4 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
第3章 綜述 miRNA在腫瘤糖酵解過(guò)程中的相關(guān)研究
    3.1 糖酵解途徑的相關(guān)激酶研究
        3.1.1 己糖激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.2 磷酸果糖激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.3 缺氧誘導(dǎo)因子與腫瘤的相互作用
        3.1.4 丙酮酸激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.5 乳酸脫氫酶與腫瘤的相互作用
    3.2 miRNA在腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑的功能
        3.2.1 miRNA調(diào)控癌基因/抑癌基因參與糖代謝
        3.2.2 miRNA對(duì)葡萄糖攝取量的影響
        3.2.3 miRNA對(duì)乳酸生成量的影響
        3.2.4 miRNA對(duì)三羧酸循環(huán)的影響
    參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間研究成果



本文編號(hào)：3886885