腰帶長體繭蜂Macrocentrus cingulum Brischke是一種重要的內(nèi)寄生蜂,亞洲玉米螟Osttinia furnacalis是一種重要的玉米害蟲。本文采用轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR,研究了腰帶長體繭蜂寄生后對亞洲玉米螟幼蟲4 h、24 h、48 h及未寄生對照組免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化情況,克隆了與天然免疫相關(guān)的鈣調(diào)磷酸酶A基因(CaNA),并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,原核表達(dá)了 CaNA蛋白,進(jìn)行了 CaNA基因的RNAi研究,為進(jìn)一步研究CaNA功能打下基礎(chǔ),主要結(jié)果如下:(1)通過與NR數(shù)據(jù)庫比對后,本實驗中亞洲玉米螟基因序列對比到家蠶Bombyx mori的基因量最多,占總比例的18%。其次為黑脈金斑蝶Danaus plexippus,占總數(shù)的11.1%。對轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行GO注釋之后,基因主要分為生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能這三類。對基因做KO注釋后,根據(jù)它們參與的KEGG代謝通路進(jìn)行分類,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因最多。對轉(zhuǎn)錄組所有的免疫基因進(jìn)行熱圖分析發(fā)現(xiàn)基因聚集成5個cluster,在數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)CaNA基因?qū)儆诘谒膫�cluster。(2)對寄生后 Of-GRP...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻(xiàn)綜述
    1 生物防治與寄生蜂
    2 昆蟲的天然免疫系統(tǒng)
    3 昆蟲免疫相關(guān)基因的調(diào)控作用
    4 鈣調(diào)磷酸酶的功能
    5 昆蟲轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展
    6 研究目的和意義
    參考文獻(xiàn)
第一章 腰帶長體繭蜂寄生亞洲玉米螟后轉(zhuǎn)錄組分析及免疫相關(guān)基因檢測
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
        2.4 對腰帶長體繭峰寄生后亞洲玉米螟幼蟲的轉(zhuǎn)錄組分析
            2.4.1 Total RNA的提取
            2.4.2 Oligo(dT)富集mRNA
            2.4.3 片段化mRNA
            2.4.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            2.4.5 上機(jī)測序
            2.4.6 生物信息分析流程
        2.5 腰帶長體繭蜂寄生亞洲玉米螟后免疫相關(guān)基因表達(dá)的檢測
            2.5.1 腰帶長體繭蜂寄生4齡初亞洲玉米螟幼蟲
            2.5.2 總RNA提取及質(zhì)量檢測
            2.5.3 總RNA質(zhì)量檢測
            2.5.4 cDNA的合成
            2.5.5 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控
        3.2 測序錯誤率分布檢查
        3.3 拼接轉(zhuǎn)錄本長度分布
        3.4 基因功能注釋
            3.4.1 Nr注釋結(jié)果
            3.4.2 GO分類
            3.4.3 KOG分類
            3.4.4 KEGG分類
        3.5 基因表達(dá)水平分析
            3.5.1 參考序列比對
            3.5.2 基因FPKM密度分布圖
        3.6 差異表達(dá)分析
            3.6.1 樣品間相關(guān)性檢查
            3.6.2 差異基因篩選
            3.6.3 GO富集分析
            3.6.4 對照組與寄生后處理組不同時間免疫基因比較
        3.7 腰帶長體繭蜂寄生亞洲玉米螟后免疫相關(guān)基因表達(dá)水平分析
            3.7.1 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲GRP3基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
            3.7.2 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲PAP基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
            3.7.3 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲Serpin1基因表達(dá)的影響
            3.7.4 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲PPO2基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
            3.7.5 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲DDC基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
            3.7.6 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟幼蟲JHDK基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
    4 討論
        4.1 腰帶長體繭峰寄生后亞洲玉米螟幼蟲的轉(zhuǎn)錄組分析
        4.2 腰帶長體繭蜂繭蜂寄生后對亞洲玉米螟免疫基因的相關(guān)影響
        4.3 轉(zhuǎn)錄組測序的偏好性
        4.4 展望
第二章 亞洲玉米螟鈣調(diào)磷酸酶A亞基(CaNA)的克隆及表達(dá)分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
        2.4 亞洲玉米螟總RNA的提取及cDNA的合成
            2.4.1 總RNA的提取
            2.4.2 總RNA質(zhì)量檢測
            2.4.3 生成RACE-Ready cDNA
        2.5 Of-CaNA基因的3'RACE
            2.5.1 引物設(shè)計
            2.5.2 操作步驟
            2.5.3 目的基因片段的回收純化
            2.5.4 目的片段與克隆載體連接
            2.5.5 連接載體轉(zhuǎn)化
            2.5.6 單菌落PCR檢測
            2.5.7 質(zhì)粒DNA提取及測序
        2.6 Of-CaNA基因結(jié)構(gòu)域序列的擴(kuò)增
        2.7 Of-CaNA基因結(jié)構(gòu)域序列的生物信息學(xué)分析
            2.7.1 亞洲玉米螟CaNA基因結(jié)構(gòu)域編碼蛋白的理化性質(zhì)分析
            2.7.2 亞洲玉米螟CaNA基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析
            2.7.3 基于Of-CaNA核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.8 Of-CaNA重組蛋白原核表達(dá)
            2.8.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Of-CaNA的構(gòu)建
            2.8.2 重組表達(dá)
            2.8.3 表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定
        2.9 腰帶長體繭蜂寄生亞洲玉米螟后CaNA基因表達(dá)的檢測
            2.9.1 腰帶長體繭蜂寄生4齡初亞洲玉米螟幼蟲
            2.9.2 總RNA提取及質(zhì)量檢測
            2.9.3 cDNA的合成
        2.10 亞洲玉米螟幼蟲注射CaNA-dsRNA后表達(dá)水平的檢測
            2.10.1 CaNA RNAi引物設(shè)計
            2.10.2 dsRNA的制備
            2.10.3 亞洲玉米螟幼蟲dsRNA的注射、取樣及Real timePCR檢測
        2.11 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 Of-CaNA基因的克隆
            3.1.1 Of-CaNA基因cDNA序列的3'RACE
            3.1.2 Of-CaNA基因部分cDNA序列的克隆及序列驗證
            3.1.3 Of-CaNA基因結(jié)構(gòu)域的亞克隆
        3.2 Of-CaNA基因序列的生物信息學(xué)分析
            3.2.1 Of-CaNA基因結(jié)構(gòu)域cDNA核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列
            3.2.2 Of-CaNA基因核苷酸序列和氨基酸序列的BlastP分析
            3.2.3 Of-CaNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹
            3.2.4 Of-CaNA基因的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及翻譯后修飾分析
            3.2.5 Of-CaNA基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋、疏水性和三維結(jié)構(gòu)分析
        3.3 Of-CaNA基因的原核表達(dá)
            3.3.1 Of-CaNA-pET-28a基因表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.2 pET-28a-Of-CaNA原核表達(dá)條件的篩選
        3.4 腰帶長體繭蜂寄生對亞洲玉米螟CaNA基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
        3.5 亞洲玉米螟幼蟲CaNA基因RNA干擾
            3.5.1 特異性T7引物與模板PCR
            3.5.2 CaNA dsRNA的制備驗證
            3.5.3 亞洲玉米螟幼蟲CaNA基因RNA干擾后CaNA表達(dá)水平分析
    4 討論
        4.1 Of-CaNA基因的結(jié)構(gòu)特征分析
        4.2 鈣調(diào)磷酸酶調(diào)控昆蟲免疫反應(yīng)
        4.3 亞洲玉米螟幼蟲CaNA基因RNAi
        4.4 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3859691