背景:致病性鉤端螺旋體(Lerptospira,簡稱鉤體)感染引起的鉤端螺旋體病(leptospirasis)是全球流行的人獸共患性疾病,也是我國重點防疫和監(jiān)控的主要傳染病之一。致病性鉤體通過黏膜或破損皮膚侵入人體后,迅速進入血流引起中毒性敗血癥,臨床主要表現(xiàn)為高熱、肌痛、全身淺表淋巴結(jié)腫大,隨后穿越小血管播散至肺、肝和腎等臟器加重病情。黏附細胞與侵入宿主是病原微生物致病的前提,但致病性鉤體黏附因子及其作用機制迄今了解甚少。血管假性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)是關(guān)鍵凝血因子,其A區(qū)(v WF-A)可分別與血小板表面糖蛋白Ib(GPIb)受體和膠原蛋白(collagen,COL)結(jié)合,使血小板聚集于血管內(nèi)皮破損后暴露COL的基底膜,發(fā)揮抑制出血作用。我們發(fā)現(xiàn),致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株LA＿0012、LA＿0697和LA＿4207基因產(chǎn)物中含有v WF-A超家族結(jié)構(gòu)域,但無與血小板GPIb受體結(jié)合位點,但此類基因產(chǎn)物的致病作用與機制迄今未見研究報道。我們推測,上述v WF-A基因產(chǎn)物介導(dǎo)問號鉤體黏附細胞胞外基質(zhì)(extracellular ma...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 引言
    1.1 鉤端螺旋體
    1.2 鉤端螺旋體病
    1.3 黏附
    1.4 人血管假性血友病因子
    1.5 研究內(nèi)容和目的
        1.5.1 研究內(nèi)容
        1.5.2 研究目的
    1.6 研究路線
第二章 問號鉤端螺旋體目的基因原核表達系統(tǒng)構(gòu)建、相應(yīng)抗體制備以及效價測定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗儀器及耗材
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 試劑配制
        2.1.4 實驗菌株
        2.1.5 實驗質(zhì)粒
    2.2 實驗方法
        2.2.1 問號鉤體LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因產(chǎn)物生物信息學分析
        2.2.2 問號鉤端螺旋體的培養(yǎng)
        2.2.3 問號鉤端螺旋體基因組DNA的提取
        2.2.4 問號鉤端螺旋體LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因產(chǎn)物的擴增
        2.2.5 E.coli DH5α和 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞的制備
        2.2.6 LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因的T-A克隆
        2.2.7 LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因的原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建
        2.2.8 rLep0012、rLep0697和rLep4207 誘導(dǎo)表達
        2.2.9 SDS-PAGE電泳
        2.2.10 14kDa蛋白透析袋的預(yù)處理
        2.2.11 目的重組蛋白的純化與收集
        2.2.12 rLep0697的復(fù)性
        2.2.13 目的重組蛋白IgG的制備
        2.2.14 免疫雙向擴散法檢測目的重組蛋白IgG的效價
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 問號鉤體LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因產(chǎn)物生物信息學分析
        2.3.2 目的基因片段擴增和測序結(jié)果
        2.3.3 目的重組蛋白表達純化及相應(yīng)IgG的制備
第三章 ELISA檢測目的重組蛋白與人膠原蛋白結(jié)合情況
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗儀器及耗材
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 r Lep0012、r Lep0697和r Lep4207 蛋白濃度的測定
        3.2.2 ELISA檢測r Lep0012、r Lep0697和r Lep4207與COLs結(jié)合
    3.3 實驗結(jié)果
第四章 表面等離子共振技術(shù)檢測目的重組蛋白與人膠原蛋白結(jié)合情況
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗儀器及耗材
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 試劑配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 氨基偶聯(lián)法
        4.2.2 進樣
    4.3 實驗結(jié)果
第五章 問號鉤端螺旋體感染細胞后目的基因表達及外分泌情況
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗菌株
        5.1.2 實驗細胞
        5.1.3 實驗儀器及耗材
        5.1.4 實驗試劑
        5.1.5 試劑配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細胞培養(yǎng)
        5.2.2 問號鉤端螺旋體培養(yǎng)
        5.2.3 問號鉤端螺旋體計數(shù)
        5.2.4 RT-PCR引物設(shè)計
        5.2.5 問號鉤端螺旋體感染細胞模型的建立
        5.2.6 LA₀012、LA₀697和LA₄207 基因m RNA表達水平檢測
        5.2.7 Lep0012、Lep0697和Lep4207蛋白表達檢測
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 鉤體感染細胞后目的基因mRNA水平增高
        5.3.2 鉤體感染細胞后目的蛋白表達水平增高
第六章 討論
參考文獻
綜述 血管假性血友病因子(vWF)參與止血過程的研究進展
    參考文獻
附錄
作者簡歷與攻讀學位期間所取得的科研成果



本文編號：3774447