偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)作為豬的一種重要病原體,在全球廣泛傳播。長(zhǎng)期以來(lái),PRV受到獸醫(yī)學(xué)家、病毒學(xué)家以及神經(jīng)生物學(xué)家的廣泛關(guān)注及研究,目前對(duì)PRV的研究已經(jīng)為皰疹病毒發(fā)病機(jī)制提供了相當(dāng)全面的參考依據(jù)。2018年中國(guó)上海報(bào)道了首例人類感染PRV的情況,引起相關(guān)研究學(xué)者們強(qiáng)烈重視。單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)UL12基因編碼一種堿性核酸酶(Alkaline nuclease,AN),AN由皰疹病毒科基因組中共同保守序列編碼。有研究報(bào)道HSV UL12誘導(dǎo)的mtDNA應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)先天性抗病毒反應(yīng),本研究以PRV UL12基因?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)其相關(guān)功能做出初步探究。主要內(nèi)容為:1.pEGFP-N1-UL12重組質(zhì)粒的構(gòu)建與PRV UL12蛋白生物信息學(xué)分析參考GenBank中PRV UL12基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以PRV-XJ株為模板,PCR擴(kuò)增UL12目的基因并成功構(gòu)建pEGFP-N1-UL12重組質(zhì)粒;通過(guò)生物信息學(xué)方法針對(duì)PRV UL12氨基酸的序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。2.PRV UL12真核表達(dá)及其細(xì)胞定位將pEGFP-...

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 偽狂犬病毒研究進(jìn)展
        1.1 病原學(xué)
        1.2 病毒分子生物學(xué)特征
        1.3 病毒復(fù)制過(guò)程
            1.3.1 病毒穿入
            1.3.2 核內(nèi)反應(yīng)
            1.3.3 病毒釋放
        1.4 潛伏與神經(jīng)侵染
        1.5 病毒凋亡基因抑制
        1.6 UL12 基因研究進(jìn)展
    2 細(xì)胞凋亡
        2.1 形態(tài)和生化特征
        2.2 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路
            2.2.1 外源性細(xì)胞凋亡途徑
            2.2.2 內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑
            2.2.3 其他凋亡途徑
    3 研究目的及意義
第二章 PRV UL12 基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    1.實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 病毒、菌株與細(xì)胞
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 偽狂犬病毒UL12 基因的擴(kuò)增
            2.1.1 特異性引物設(shè)計(jì)
            2.1.2 PRV增殖
            2.1.3 PRV DNA抽提
            2.1.4 PCR擴(kuò)增
            2.1.5 目的片段純化回收
        2.2 構(gòu)建PEGFP-N1-UL12 重組質(zhì)粒
            2.2.1 目的片段與pEGFP-N1 真核表達(dá)載體雙酶切
            2.2.2 雙酶切目的片段回收
            2.2.3 目的片段連接至pEGFP-N1 真核表達(dá)載體
            2.2.4 制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
            2.2.6 重組質(zhì)粒鑒定
        2.3 PRV UL12 生物信息學(xué)分析
            2.3.1 PRV UL12 蛋白理化性質(zhì)分析
            2.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            2.3.3 PRV UL12 蛋白信號(hào)肽分析
            2.3.4 PRV UL12 蛋白相關(guān)位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.3.5 PRV UL12 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
    3 結(jié)果與分析
        3.1 PRV UL12 基因擴(kuò)增
        3.2 PEGFP-N1-UL12 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.3 PRV UL12 蛋白生物信息分析
            3.3.1 PRV UL12 蛋白理化性質(zhì)分析
            3.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            3.3.3 PRV UL12 蛋白信號(hào)肽分析
            3.3.4 PRV UL12 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            3.3.5 PRV UL12 蛋白N端糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            3.3.6 PRV UL12 蛋白O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            3.3.7 PRV UL12 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 PRV UL12 基因的真核表達(dá)及細(xì)胞定位
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要試劑
        1.2 細(xì)胞
        1.3 主要儀器
        1.4 主要溶液配置
    2 方法
        2.1 PEGFP-N1-UL12 去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提
        2.2 PEGFP-N1-UL12 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21 細(xì)胞
        2.3 樣品制備
        2.4 WESTERN BLOT檢測(cè)
        2.5 UL12-GFP融合蛋白細(xì)胞定位
    3 結(jié)果
        3.1 GFP綠色熒光蛋白表達(dá)
        3.2 WESTERN BLOT檢測(cè)結(jié)果
        3.3 PRV UL12在BHK21 細(xì)胞中的定位
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 PRV UL12 基因在BHK21 細(xì)胞凋亡中的作用及其對(duì)PRV增殖的影響
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要試劑
        1.2 病毒
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 綠色熒光蛋白表達(dá)差異分析
        2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BHK21 細(xì)胞凋亡率
        2.3 QPCR測(cè)定CASPASE-3 凋亡因子表達(dá)情況
            2.3.1 引物設(shè)計(jì)
            2.3.2 細(xì)胞樣品總RNA抽提
            2.3.3 RT-PCR反應(yīng)
            2.3.4 qPCR測(cè)定caspase-3 凋亡因子
        2.4 體外表達(dá)PRV UL12對(duì)PRV增殖的影響
    3 結(jié)果
        3.1 GFP綠色熒光蛋白表達(dá)
        3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果
        3.3 CASPASE-3 凋亡因子表達(dá)情況
        3.4 體外表達(dá)PRV UL12對(duì)PRV增殖的影響
    4 討論
    5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3755342