維管植物的維管束（vascular bundle）是植物體最主要的輸導(dǎo)組織,其形成與發(fā)育是一個(gè)受多種基因和調(diào)控途徑共同作用的生化過程。本實(shí)驗(yàn)室從煙草中克隆了一個(gè)在維管束中特異表達(dá)的新基因sm-Nvas。為了初步分析其功能,利用CaMV35S為啟動(dòng)子,與sm-Nvas全基因序列和GUS相連接形成融合基因,構(gòu)建了表達(dá)載體CaMV35S::sm-Nvas::GUS,并遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株,表現(xiàn)出矮化、莖和葉脈增粗、維管束列數(shù)增多、維管束薄壁細(xì)胞的長(zhǎng)度縮短等特征。因此,初步認(rèn)為sm-Nvas與維管束發(fā)育相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)完成的主要內(nèi)容包括以下兩個(gè)方面:（1）在此基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步探討該基因的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)煙草維管束發(fā)育相關(guān)基因sm-Nvas中的兩段序列進(jìn)行敲除,并成功構(gòu)建了pc1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體,將構(gòu)建好的敲除載體電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染煙草葉盤,完成遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定及基因編輯分析,對(duì)陽性植株和野生型植株進(jìn)行對(duì)比觀察,進(jìn)一步確定該基因在維管束生長(zhǎng)發(fā)育過程中所起到的作用。（2）本研究還構(gòu)建了pMAL-p5x-sm... 

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 維管束及其發(fā)育調(diào)控
        1.1.1 維管束簡(jiǎn)介
        1.1.2 維管束的發(fā)育調(diào)控
    1.2 基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用
        1.2.1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.2.2 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和作用
        1.2.3 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.3 pMAL原核表達(dá)載體的功能與應(yīng)用
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 煙草品種
        2.2.2 菌株及載體
        2.2.3 主要試劑及配方
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構(gòu)建
        2.3.2 陽性克隆電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas煙草遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.4 轉(zhuǎn)基因T0代植株的陽性鑒定
        2.3.5 轉(zhuǎn)基因T0代植株的表型分析及切片觀察
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的構(gòu)建
        2.4.2 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除載體的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4.3 轉(zhuǎn)基因苗的陽性鑒定
        2.4.4 轉(zhuǎn)基因苗的基因敲除檢測(cè)
        2.4.5 轉(zhuǎn)基因T0代植株的表型分析與切片觀察
    2.5 討論
第三章 sm-Nvas原核表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白純化
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 煙草品種
        3.2.2 載體及菌株
        3.2.3 主要試劑及配方
        3.2.4 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.3 表達(dá)蛋白純化
    3.5 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
參與的學(xué)術(shù)會(huì)議


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]稻瘟病新抗性基因Pi39候選基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建[J]. 劉早利,陳亞紅,王春臺(tái),劉新瓊.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2016(06)
[2]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點(diǎn)編輯中的研究進(jìn)展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(09)
[3]重組MBP-GnRH6融合蛋白的表達(dá)與鑒定[J]. 王索路,方富貴,劉亞,章孝榮,李運(yùn)生,張運(yùn)海,陶勇,曹鴻國(guó).  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2010(02)
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[5]人胰島素原C肽基因高效表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 于祥,秦文浩.  南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2005(01)

碩士論文
[1]水稻ORF216蛋白和煙草SM-NGT1蛋白的原核表達(dá)研究[D]. 胡婧.中南民族大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3727082