Wnt/β-catenin信號(hào)通路在進(jìn)化中高度保守。在胚胎發(fā)育過程中,其在細(xì)胞分化、增殖、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在成體組織中,其對(duì)成體干細(xì)胞自我更新能力的維持、組織的損傷修復(fù)發(fā)揮著重要的作用。Wnt信號(hào)的失調(diào)不但對(duì)腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要,而且對(duì)晚期腫瘤的轉(zhuǎn)移形成起到了關(guān)鍵作用。因此,Wnt信號(hào)通路是非常具有吸引力的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。本課題的主要研究目標(biāo)是系統(tǒng)性尋找參與Wnt信號(hào)通路的重要調(diào)控分子。本課題結(jié)合Wnt/β-catenin信號(hào)通路報(bào)告細(xì)胞系和CRISPR/Cas全基因組篩選技術(shù),通過兩輪篩選及生物信息學(xué)分析,尋找參與Wnt信號(hào)通路下游調(diào)控的信號(hào)分子。為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果,選取多個(gè)篩選基因,并將其逐個(gè)在報(bào)告細(xì)胞中敲除。在基因敲除后的報(bào)告細(xì)胞內(nèi),通過RT-QPCR技術(shù)檢測(cè)Wnt下游基因Axin2 mRNA的表達(dá),通過WB技術(shù)檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá),進(jìn)而驗(yàn)證篩選得到的基因是否對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。第一輪篩選富集了460個(gè)基因,其中已知的Wnt信號(hào)分子占3.5%,第二輪富集了29個(gè)基因,已知的Wnt信號(hào)分子占20.7%。表明我們第二輪篩選更有效的富集了與Wn... 

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 WNT/β-CATENIN信號(hào)通路
        1.1.1 Wnt信號(hào)通路的類型
        1.1.2 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路
    1.2 WNT/β-CATENIN信號(hào)通路與疾病
    1.3 CRISPR / CAS系統(tǒng)
    1.4 基因篩選策略
    1.5 本課題的主要研究?jī)?nèi)容
第2章 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 抗體
        2.1.3 試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng),傳代和凍存
        2.2.2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.2.3 慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染
        2.2.4 擴(kuò)增全基因組敲除的g RNA文庫(kù)
        2.2.5 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)步驟
        2.2.6 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測(cè)細(xì)胞活力
        2.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分選與分析
        2.2.8 苯酚/氯仿方法提取細(xì)胞基因組DNA
        2.2.9 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的片段
        2.2.10 磁珠純化DNA片段
        2.2.11 二代測(cè)序及生物信息學(xué)分析
        2.2.12 構(gòu)建表達(dá)g RNA和cas9的質(zhì)粒
        2.2.13 Trizol法提取的細(xì)胞總的RNA
        2.2.14 RT-QPCR測(cè)基因表達(dá)
        2.2.15 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)蛋白水平的表達(dá)(Western Blot)
第3章 結(jié)果
    3.1 建立CRISPR/CAS篩選所需的細(xì)胞系
        3.1.1 建立Wnt/β-catenin信號(hào)通路報(bào)告細(xì)胞系
        3.1.2 建立穩(wěn)定表達(dá)Cas9的報(bào)告細(xì)胞系
    3.2 CRISPR/CAS基因篩選系統(tǒng)的建立
        3.2.1 人類全基因組g RNA文庫(kù)的分布
        3.2.2 慢病毒g RNA文庫(kù)包裝和感染
        3.2.3 流式分析基因敲除后細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度的變化
        3.2.4 g RNA的建庫(kù)以及質(zhì)量控制
        3.2.5 生信分析原始g RNA文庫(kù)與Baseline的差異
    3.3 第一輪篩選
    3.4 對(duì)富集的GRNA進(jìn)行第二輪篩選
    3.5 兩輪篩選的比較
    3.6 驗(yàn)證CRISPR/CAS篩選得到的信號(hào)分子
        3.6.1 第一次驗(yàn)證候選基因
        3.6.2 在給 CHIR 3um 的情況下再次驗(yàn)證候選基因
        3.6.3 檢測(cè)候選基因敲除對(duì)Axin2表達(dá)的影響
        3.6.4 候選基因與疾病的關(guān)系
    3.7 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3701928