吡啶及其衍生物在自然界中普遍存在,6-羥基煙酸（6HNA）作為吡啶衍生物中重要的化工中間體,化學(xué)合成困難,而微生物轉(zhuǎn)化的方法因其溫和、流程簡單和產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2為對象,研究了其降解煙酸（NA）的特性、代謝途徑及分子降解機(jī)制。通過基因組測序和生物信息比較相結(jié)合的方法克隆到一個(gè)新的三組分編碼煙酸羥化酶的基因,為綠色轉(zhuǎn)化6HNA的生產(chǎn)提供了理論方法和依據(jù)。研究內(nèi)容主要包括以下三個(gè)方面:（1）研究了菌株T2對NA的降解特性,并對其代謝途徑進(jìn)行了推測。結(jié)果顯示:菌株T2對NA的最適降解條件為30℃和pH7.0;當(dāng)接種量OD600為0.60時(shí),可以在3.5個(gè)小時(shí)內(nèi)將濃度為300 mg/L的NA完全降解;推測其降解途徑為 NA→6HNA→2,5-DHP→→TCA 循環(huán)。（2）通過對菌株T2進(jìn)行全基因組測序,獲得了基因組序列的精細(xì)圖譜（52個(gè)Scaffolds）。菌株T2的基因組大小為3.3 Mb,GC含量為56.9%。生物信息學(xué)表明,該菌株基因組編碼3054個(gè)開放閱讀框。利用RAST、nr、Swiss-Prot、COG、KE... 

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
符號與縮略語說明
第一章 緒論
    1.1 煙堿類殺蟲劑
        1.1.1 煙堿類殺蟲劑的發(fā)展
        1.1.2 煙堿類殺蟲劑中間體的研究
    1.2 煙酸和6-羥基煙酸的簡介
        1.2.1 煙酸和6-羥基煙酸的基本性質(zhì)
        1.2.2 煙酸和6-羥基煙酸的用途
    1.3 煙酸的微生物降解的研究進(jìn)展
        1.3.1 降解煙酸的微生物種類
        1.3.2 煙酸的微生物代謝途徑及酶學(xué)研究
    1.4 本論文研究目的、意義和主要內(nèi)容
        1.4.1 研究目的和意義
        1.4.2 研究的主要內(nèi)容
第二章 煙酸降解菌的生長及降解特性研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株、試劑及儀器
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 緩沖液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌株T2對煙酸降解能力的初步驗(yàn)證
        2.2.2 菌株T2種子液的制備
        2.2.3 菌株T2的生物量及煙酸殘留量和中間代謝產(chǎn)物的檢測方法
        2.2.4 外界條件對菌株T2降解特性的影響
        2.2.5 菌株T2生長與煙酸降解關(guān)系的探究
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 菌株T2對煙酸的降解能力
        2.3.2 pH值對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.3 溫度對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.4 接種量對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.5 煙酸初始濃度對菌株T2降解煙酸的影響
        2.3.6 菌株T2對煙酸的利用
        2.3.7 菌株T2降解代謝產(chǎn)物的鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 Pusillimonas sp. T2基因組測序、功能注釋分析及基因比較
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.1.1 菌株,試劑與培養(yǎng)基
        3.1.2 基因組DNA提取
        3.1.3 全基因組序列上機(jī)文庫的構(gòu)建
        3.1.4 生物學(xué)信息分析
        3.1.5 煙酸降解關(guān)鍵基因的查找和生物信息學(xué)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 菌株T2基因組DNA提取
        3.2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        3.2.3 基因組序列的組裝
        3.2.4 預(yù)測基因結(jié)果
        3.2.5 rRNA/tRNA預(yù)測結(jié)果
        3.2.6 基因功能注釋結(jié)果
        3.2.7 煙酸代謝相關(guān)基因分析
    3.3 本章小結(jié)
第四章 煙酸降解關(guān)鍵基因nahAB_1B_2的克隆與功能鑒定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        4.1.3 主要試劑及緩沖液
        4.1.4 引物設(shè)計(jì)
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 菌株T2基因組DNA提取
        4.2.2 菌株T2基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測
        4.2.3 質(zhì)粒DNA的小量提取
        4.2.4 Over-lap PCR構(gòu)建同源重組片段
        4.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.2.6 表達(dá)載體的構(gòu)建
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 菌株T2基因組DNA提取
        4.3.2 nahA、nahAB_1和nahB_2的特異性擴(kuò)增
        4.3.3 載體pBBR-MCS2酶切
        4.3.4 重組菌株的煙酸降解功能驗(yàn)證
    4.4 本章小結(jié)
第五章 酶學(xué)特性研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        5.1.3 主要試劑及緩沖液
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 表達(dá)菌株的誘導(dǎo)與表達(dá)
        5.2.2 蛋白的功能鑒定
    5.3 菌株HZN7-pBBR-nahAB_1B_2粗酶液特性研究
        5.3.1 粗酶液中蛋白含量測定
        5.3.2 NahAB_1B_2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        5.3.3 金屬離子對酶活力的影響
        5.3.4 O_2消耗檢測
        5.3.5 NahAB_1B_2底物特異性檢測
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.4.1 NahAB_1B_2的活性
        5.4.2 酶含量和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        5.4.3 金屬離子對NahAB_1B_2酶活的影響
        5.4.4 NahAB_1B_2催化反應(yīng)中O_2的來源
        5.4.5 NahAB_1B_2的底物特異性
    5.5 本章小結(jié)
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 研究內(nèi)容及結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 不足與展望
參考文獻(xiàn)
附錄1: 儀器設(shè)備
附錄2: 文中所用培養(yǎng)基及試劑配方
附錄3: 緩沖液
附錄4: 相關(guān)DNA序列
作者簡介
    1 作者簡歷
    2 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
    3 參與的科研項(xiàng)目
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]尼古丁降解菌Pusillimonas sp.T2的篩選、鑒定、降解特性及代謝途徑的初步研究[D]. 溫榮提.浙江工業(yè)大學(xué) 2015



本文編號：3698915