目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)與同源重組技術(shù)在組蛋白去甲基化酶Kdm2b基因的特定位置敲入雙loxp序列,為后期制備條件性敲除鼠及基因功能研究提供基礎(chǔ)。方法利用CRISPR/Cas9靶向性原理,根據(jù)Kdm2b基因第7個外顯子的5臂端和第9個外顯子的3臂端設(shè)計兩個sgRNA,構(gòu)建sgRNA-PX459重組質(zhì)粒。從Kdm2b基因上克隆出同源臂,將同源臂插入帶有l(wèi)oxp序列的Vector 5中,利用引物從Vector 5質(zhì)�？寺〉玫絣oxp-同源臂序列的雙鏈Donor DNA。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將sgRNA-PX459重組質(zhì)粒和雙鏈Donor DNA導(dǎo)入小鼠NIH3T3細(xì)胞,利用嘌呤霉素篩選細(xì)胞,挑選陽性單克隆。提取NIH3T3細(xì)胞基因組進(jìn)行PCR,對PCR產(chǎn)物酶切鑒定,同時對Kdm2b基因進(jìn)行測序。結(jié)果電泳和測序結(jié)果顯示sgRNA-PX459重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,雙鏈Donor DNA測序結(jié)果與設(shè)計相符合,成功在NIH3T3細(xì)胞Kdm2b基因上第7個外顯子的5臂端和第9個外顯子的3臂端各敲入一個loxp序列。結(jié)論獲得Kdm2b基因敲入雙loxp序列的NIH3T3細(xì)胞株。 

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料
    1.2 定點(diǎn)切割雙鏈基因組DNA的sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
    1.3 帶有l(wèi)oxp序列的雙鏈Donor DNA的設(shè)計與構(gòu)建
    1.4 特定切割位點(diǎn)loxp序列敲入
        1.4.1 sgRNA5切割位點(diǎn)的loxp序列敲入
        1.4.2 sgRNA3切割位點(diǎn)的loxp序列敲入
2 結(jié)果
3 討論



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