鴨源雞桿菌是巴氏桿菌科雞桿菌屬的代表種,為革蘭氏陰性菌。研究表明其在一定條件下能夠引起蛋雞生殖系統(tǒng)的損傷、腹膜炎及敗血癥和呼吸道疾病等,造成產蛋量下降,死亡率上升。鴨源雞桿菌存在多重耐藥性及固有抗原的多樣性,這使得抗生素及疫苗對該病的防治效果不甚理想,給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經濟損失越來越嚴重。目前,鴨源雞桿菌致病機理的研究還十分有限,僅有少數(shù)幾個預測的毒力因子得到的確認,其中包括新型的RTX毒素Gtx A、多糖莢膜、金屬蛋白酶和粘附素等。本試驗首次針對鴨源雞桿菌外膜蛋白W（OmpW）開展了初步研究,首先借助PCR及生物信息學方法,獲得了OmpW基因在鴨源雞桿菌中分布狀態(tài)、預測了其可能存在的抗原表位,并利用鴨源雞桿菌OmpW的原核表達產物制備多克隆抗體,對其免疫原性進行了研究。為進一步的研究OmpW基因的功能,本試驗首次在國內利用靶向基因操作技術成功構建了鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因突變株Δomp W。1.鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因擴增及生物信息學分析本研究參照GenBank中公布的UMN179的OmpW基因序列,設計一對通用引物,通過PCR對32株不同來源的鴨源雞桿菌OmpW基因進行擴增,首次對鴨源... 

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
英文縮寫詞表
摘要
文獻綜述
    1 雞桿菌概述
        1.1 雞桿菌分類地位的確立
        1.2 雞桿菌的致病性
        1.3 鴨源雞桿菌主要毒力因子
    2 外膜蛋白
        2.1 外膜蛋白概述
        2.2 外膜蛋白W（Outer membrane protein W, OmpW）
    3 基因功能研究方法
        3.1 基因生物信息學分析
        3.2 基因的表達譜分析
        3.3 蛋白相互作用研究
        3.4 基因功能的實驗學驗證
    4 基因敲除(Gene knock)技術
        4.1 隨機插入突變法
        4.2 基因重組技術
        4.3 RNA干擾
    5 基因敲除技術在鴨源雞桿菌中的應用
    6 小結
試驗研究
    試驗一 鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因克隆及生物信息學分析
        引言
        1 材料與方法
            1.1 菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設備
            1.4 引物設計與合成
            1.5 細菌的培養(yǎng)
            1.6 OmpW基因的擴增及測序
            1.7 OmpW核苷酸及編碼氨基酸序列分析
            1.8 OmpW理化性質分析
            1.9 OmpW信號肽及結構分析
            1.10 OmpW B細胞抗原表位預測
        2 結果與分析
            2.1 OmpW基因的PCR擴增
            2.2 OmpW核苷酸序列分析
            2.3 OmpW氨基酸同源性分析
            2.4 OmpW的理化性質
            2.5 OmpW信號肽及結構分析
            2.6 OmpW線性B細胞抗原表位預測
        3 討論
    試驗二 鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因的表達及抗原性鑒定
        前言
        1 材料和方法
            1.1 菌株和質粒
            1.2 酶及主要試劑
            1.3 主要儀器設備
            1.4 引物設計及合成
            1.5 細菌基因組DNA的制備
            1.6 OmpW基因的擴增
            1.7 重組表達質粒的構建及鑒定
            1.8 重組菌的誘導表達
            1.9 OmpW蛋白的純化和Western blot鑒定
            1.10 多克隆抗體的制備及鑒定
        2 結果與分析
            2.1 OmpW基因的擴增
            2.2 重組表達質粒的鑒定
            2.3 表達產物的SDS-PAGE分析
            2.4 原核表達OmpW Western blotting鑒定
            2.5 OmpW免疫原性分析
        3 討論
    試驗三 鴨源雞桿菌OmpW基因敲除株的構建
        引言
        1 菌株與材料
            1.1 菌株與質粒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設備
            1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        2 方法
            2.1 國內菌株自然感受基因的檢測
            2.2 鴨源雞桿菌ΔOmpW突變株的構建
        3 結果與分析
            3.1 鴨源雞桿菌PDS-RZ-1-SLG基因組含有自然感受基因
            3.2 主要自然感受相關基因測定
            3.3 OmpW基因上下游同源臂及CMP抗性盒子的擴增
            3.4 pUC18-S-C-X質粒的酶切鑒定
            3.5 鴨源雞桿菌突變株的鑒定
        4 討論
全文總結
參考文獻
附:作者讀研期間發(fā)表文章
ABSTRACT


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨源雞桿菌致病力與生物被膜形成能力及耐藥性的相關性分析研究[J]. 張秀平,陳陸,趙軍,王川慶,王新衛(wèi),常洪濤,劉紅英,盧彩景,楊霞.  中國獸醫(yī)學報. 2014(10)
[2]大腸桿菌外膜蛋白ompW基因敲除菌的構建及其對兩種抗生素的敏感性[J]. 吳賢斌,鄒海杰,田麗花,潘建義,趙輔昆.  微生物學報. 2012(08)
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[4]基因敲除技術及其在微生物育種中的應用[J]. 張紅巖,申乃坤,周興.  釀酒科技. 2010(04)
[5]45株雞卡氏桿菌的分離鑒定[J]. 鄭鹿平,楊霞,陳陸,皇甫和平,劉慧敏,郭倫濤,徐雪,付仁一,王澤霖,王川慶.  中國獸醫(yī)學報. 2010(03)
[6]基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構建腸炎沙門氏菌突變株方法的比較[J]. 朱春紅,孫曉慶,何素芬,朱國強.  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(02)
[7]蛋雞群卡氏桿菌感染情況的初步研究[J]. 王川慶,陳陸,楊霞,皇甫和平,劉紅英,彭志峰,鄭鹿平,徐雪,劉惠敏,付仁一,郭輪濤.  河南農業(yè)科學. 2008(03)
[8]一種新的基因敲除術-RNAi[J]. 李穎平,張映,邵國青.  生物技術通報. 2006(03)
[9]植物功能基因組研究中的基因敲除技術[J]. 陳其軍,肖玉梅,王學臣,周海夢.  植物生理學通訊. 2004(01)
[10]細菌耐藥機制與臨床治療對策[J]. 王睿,柴棟.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊). 2003(03)

碩士論文
[1]鐵離子調節(jié)革蘭氏陰性菌外膜蛋白OmpW抗宿主氧化應激作用及機制的研究[D]. 鄒海杰.浙江理工大學 2012
[2]61株鴨源雞桿菌部分耐藥基因及其與耐藥性關系的研究[D]. 高冬生.河南農業(yè)大學 2011
[3]雞桿菌地方分離株耐藥性及耐藥基因的研究[D]. 郭倫濤.河南農業(yè)大學 2010



本文編號：3652818