目的:SLC12A3,是鈉和氯化物共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)鈉和氯化物在腎臟遠(yuǎn)端小管中的重吸收,與血壓的調(diào)節(jié)相關(guān),并作為噻嗪類利尿劑的作用靶點(diǎn)。SLC12A3的Arg913Gln變異（rs11643718,G/A）是否促進(jìn)2型糖尿病腎臟�。―KD）的發(fā)病仍存在爭(zhēng)議。我們進(jìn)行病例-對(duì)照研究,以評(píng)估SLC12A3 Arg913Gln變異與中國(guó)接受維持性血液透析治療的2型糖尿�。═2DM）患者發(fā)生終末期腎�。‥SRD）風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性,并分析基因型-表型間的相互作用。研究設(shè)計(jì)和方法:將合并糖尿病視網(wǎng)膜病、無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)T2DM患者（n=372）分為非糖尿病腎臟病對(duì)照組（non-DKD組,n=151,糖尿病病程>15年,無(wú)腎�。┖蚑2DM導(dǎo)致的ESRD組（DKD-ESRD組,n=221,終末期腎病接受維持性血液透析治療）。應(yīng)用PCR-直接測(cè)序方法,對(duì)所有372名受試者的SLC12A3-Arg913Gln變異進(jìn)行基因型分型。結(jié)果:1)DKD-ESRD組患者的GA+AA基因型頻率顯著高于非DKD對(duì)照組[23.1%vs.9.9%;校正OR值為2.2（95%CI,1.3-4.5;P=0.019）];2)... 

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PCR實(shí)驗(yàn)原理圖

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文17表4.SLC12A3Arg913GlnG/APCR反應(yīng)體系。Table4.PCRreactionsystemforSLC12A3Arg913GlnG/A.試劑體積（μl）10×PCR緩沖液250mmol/LMgCl20.82mmol/LdNTP210pm/μl正向引物210pm/μl反向引物25U/μLTaqDNA聚合酶0.230ng/μlDNA模板1DMSO1ddH209總反應(yīng)體積20⑺PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見圖2圖2.SLC12A3Arg913GlnG/A的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Figure2.PCRreactionconditionsforSLC12A3Arg913GlnG/A⑻凝膠電泳方法鑒定PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：①7μl2.5*loadingbuffer+3μlPCR產(chǎn)物反復(fù)吹打混勻，加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，同時(shí)以DNALadderMaker作為分子量參照。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文20用完畢即關(guān)閉鏡頭電源；嚴(yán)禁用粗硬的物品擦拭紫外臺(tái)，防止劃傷；切膠時(shí)在紫外透射臺(tái)上鋪一層保險(xiǎn)膜再放置凝膠，以防止切刀劃傷紫外臺(tái)。2.3.4直接測(cè)序法鑒定SLC12A3Arg913GlnG/A變異基因型⑴直接測(cè)序反應(yīng)上機(jī)前PCR反應(yīng)體系（見表5）表5.SLC12A3Arg913GlnG/A直接測(cè)序反應(yīng)體系。Table5.ThedirectsequencereactionsystemforSLC12A3-Arg913GlnG/A.試劑體積（μl）已純化的PCR產(chǎn)物2.51pmol/l正向或反向引物35×Sequence緩沖液3Big-Dye0.5ddH2011總體積20⑵測(cè)序反應(yīng)條件如圖3所示。圖3.SLC12A3Arg913GlnG/A直接測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)條件。Figure3.ThedirectsequencereactionconditionforSLC12A3Arg913GlnG/A.⑶直接測(cè)序反應(yīng)前產(chǎn)物的純化及處理用醋酸鈉/乙醇法進(jìn)行，室溫下晾干已純化的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物，操作步驟如下：a．將100μl醋酸鈉溶液加入到上述直接測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物中，將混合物轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的96孔測(cè)序板之前，應(yīng)提前在板上做好標(biāo)記：橫向標(biāo)記為1-12；

【參考文獻(xiàn)】：
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