本文關(guān)鍵詞：小菜蛾RNAi通路核心元件的基因組篩選及PxDcr-2基因的功能驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RNA干擾(RNA interference, RANi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā),使得mRNA降解或翻譯被抑制的現(xiàn)象,在真核生物中高度保守。根據(jù)生物學(xué)機(jī)制和所結(jié)合Argonaute (Ago)蛋白的不同,RNAi在生物體內(nèi)存在三條通路：小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)、小RNA(microRNA, miRNA)和PIWI互作RNA (PIWI-interacting RNA, piRNA)。雖然RNAi通路的核心元件在大多數(shù)生物中是保守的,但昆蟲(chóng)中它們的保守程度卻不盡相同。而小菜蛾是目前全球分布的重要十字花科害蟲(chóng),在蟲(chóng)體中能夠?qū)崿F(xiàn)RNAi。因此,我們利用小菜蛾基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),依據(jù)秀麗隱桿線蟲(chóng)、果蠅、赤擬谷盜和家蠶的相關(guān)信息,篩選出RNAi通路中的核心元件。本研究中,在小菜蛾中發(fā)現(xiàn)2個(gè)Dicer基因、1個(gè)Drosha、基因5個(gè)Argonaute基因、1個(gè)Pasha基因和1個(gè)Loquacious基因,但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)R2D2基因。并且對(duì)這些基因在小菜蛾中不同發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式通過(guò)qPCR進(jìn)行了分析。作為RNAi通路中的核心元件,Dicer-1蛋白主要在miRNA通路中發(fā)揮作用,Dicer-2蛋白則是siRNA形成中至關(guān)重要的。本研究中,對(duì)小菜蛾Dicer-1 (PxDcr-1)基因CDS的全長(zhǎng)和小菜蛾Dicer-2 (PxDcr-2)基因CDS的全長(zhǎng)首次進(jìn)行了克隆和分析,并且通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)對(duì)PxDcr-2基因的功能進(jìn)行了初步探索。PxDcr-1基因的CDS全長(zhǎng)為8457 bp,氨基酸序列長(zhǎng)度為2818 aa；PxDcr-2基因的CDS全長(zhǎng)為5,091bp,氨基酸序列長(zhǎng)度為1,696 aa。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析,PxDcr-1和PxDcr-2蛋白都與鱗翅目昆蟲(chóng)同源性最高,特別是黑脈金斑蝶。在RNAi干擾的實(shí)驗(yàn)中,dsDcr-2-2對(duì)PxDcr-2的1rnRNA表達(dá)量的抑制效果最佳,但在注射dsRNA后,在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中沒(méi)有明顯的表型變化。為了研究PxDcr-2在小菜蛾siRNA通路中的作用,將dsDcr-2-2和dsBursa/dsCYP同時(shí)向蟲(chóng)體注射,發(fā)現(xiàn)小菜蛾蛹的畸形率和死亡率與單獨(dú)注射dsBursa/dsCYP相比,有所下降,說(shuō)明PxDcr-2在小菜蛾RNAi通路中發(fā)揮了作用。
【關(guān)鍵詞】：小菜蛾 RNAi Dicer
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.4;Q78
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1 前言10-20
• 1.1 昆蟲(chóng)中的RNAi通路類型11-15
• 1.1.1 siRNA通路11-12
• 1.1.2 miRNA通路12-14
• 1.1.3 piRNA通路14-15
• 1.2 Dicer蛋白的研究概況15-18
• 1.2.1 Dicer蛋白的生化特征及作用方式15-16
• 1.2.2 Dicer蛋白的研究進(jìn)展16-18
• 1.3 小菜蛾體內(nèi)的RNAi研究進(jìn)展18-20
• 1.3.1 小菜蛾簡(jiǎn)介18
• 1.3.2 小菜蛾中的RNAi研究進(jìn)展18-20
• 2 材料與方法20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)20
• 2.1.2 主要試劑20
• 2.1.3 供試菌種20-21
• 2.1.4 主要儀器21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-31
• 2.2.1 基因的篩選21
• 2.2.2 序列分析21
• 2.2.3 氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建21
• 2.2.4 小菜蛾RNA的提取21-22
• 2.2.5 cDNA的合成22-23
• 2.2.6 PCR驗(yàn)證基因23-25
• 2.2.7 qPCR基因表達(dá)量測(cè)定25-27
• 2.2.8 dsRNA的合成27-29
• 2.2.9 dsRNA的注射29-30
• 2.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析30-31
• 3 結(jié)果與分析31-52
• 3.1 小菜蛾RNAi通路元件分析31-38
• 3.1.1 小菜蛾RNAi通路元件的特征31
• 3.1.2 小菜蛾RNAi通路元件蛋白結(jié)構(gòu)域及同源性31-34
• 3.1.3 小菜蛾RNAi通路核心元件的表達(dá)模式分析34-38
• 3.2 小菜蛾中Dicer基因的特征與功能驗(yàn)證38-52
• 3.2.1 PxDcr-1和PxDcr-2的氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析38-48
• 3.2.2 PxDcr-1和PxDcr-2的保守域48
• 3.2.3 PxDcr-1和PxDcr-2的三維結(jié)構(gòu)48-49
• 3.2.4 PxDcr-2的RNAi49-50
• 3.2.5 PxDcr-2對(duì)小菜蛾體內(nèi)RNAi通路的影響50-52
• 4 討論52-55
• 4.1 小菜蛾中的RNAi通路52
• 4.2 小菜蛾中RNAi通路核心元件表達(dá)模式52-53
• 4.3 PxDcr-2在RNAi通路中能夠發(fā)揮作用53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄161-62
• 附錄262-85
• 附錄385-86
• 致謝86

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