釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在燃料乙醇的生產中處于重要的地位,但釀酒酵母乙醇發(fā)酵背后的基因表達調控機制仍未被完全了解。本研究利用實驗室建立的乙醇靜態(tài)發(fā)酵模型,檢測了釀酒酵母基因組中的150個轉錄因子及其轉錄相關蛋白的單基因缺失株的乙醇產率。篩選出18個（占所有轉錄因子的10%左右）對釀酒酵母的乙醇發(fā)酵產率具有調控功能的轉錄因子。這些轉錄因子主要參與細胞周期、染色質重塑、轉錄、應激反應、蛋白質合成和脂質合成。搖瓶發(fā)酵的結果顯示,與野生型菌株相比,MBP1,UME6,SWI4,SPT10和SWI6這5個基因的單基因缺失突變菌株在接種后32 h和52 h這兩個時間點均顯示乙醇產率增加,而SRB8,NGG1,RTF1,RSC1和SWI3這5個基因的單基因缺失突變菌株僅在52 h顯示乙醇產率的顯著增加;相反,與野生型菌株相比,SEF1,INO2,INO4,RIC1,SPS18,YNR063W,HAC1和HAT1這8個基因的單基因缺失突變菌株在接種后32 h和52 h這兩個時間點測得的乙醇產率均顯著降低。顯示乙醇產率增加的10個單基因缺失突變菌株中,只有RSC1的單... 

【文章來源】：山東理工大學山東省

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

發(fā)酵32小時和52小時的乙醇產率

山東理工大學碩士學位論文第四章釀酒酵母缺失突變株的乙醇耐受性26第四章釀酒酵母缺失突變株的乙醇耐受性4.1RSC1的缺失可提高酵母細胞對乙醇的耐受性乙醇產量增長的限制因素之一是釀酒酵母在發(fā)酵期間細胞的乙醇耐受水平。因此，本實驗檢測了發(fā)酵過程中顯示出乙醇產率增加的11個單基因缺失突變菌株的乙醇耐受性，結果如圖4.1所示。首先，對活化的單基因缺失株菌株進行基因型檢測。由于實驗所用的雙倍體單基因缺失株文庫的缺失基因是被抗G418的KanMX4遺傳標記所替代，因此在各個缺失基因的上下游約200bp設計一對引物Gene-F/Gene-R，在KanMX4標記序列內部設計一對引物Kan-F/Kan-R。以各基因缺失株的基因組DNA為模板，分別用Gene-F/Kan-R和Kan-F/Gene-R進行PCR擴增，驗證KanMX4敲除盒是否整合到相應基因的位置上。然后，將基因型驗證正確的基因缺失株及野生型菌株BG分別在在YPD和YPD加不同濃度的乙醇平板上進行表現型檢測，觀察其生長情況。圖4.1乙醇耐受性的表型驗證。分別在YPD和YPD加不同濃度的乙醇平板上測試野生型菌株BG、ace2/ace2、mbp1/mbp1、swi4/swi4、swi6/swi6、srb8/srb8、swi3/swi3、rsc1/rsc1、rtf1/rtf1,、spt10/spt10,、ngg1/ngg1和ume6/ume6基因突變株的表現型。平板在30℃培養(yǎng)2天。Fig.4.1Ethanoltoleranceassay.EthanoltolerantphenotypesofthewildtypeBG(WT),theace2/ace2,thembp1/mbp1,theswi4/swi4,theswi6/swi6,thesrb8/srb8,theswi3/swi3,thersc1/rsc1,thertf1/rtf1,thespt10/spt10,thengg1/ngg1andtheume6/ume6mutantsonYPDplatesandYPDplatescontainingindicatedconcentrationsofethanol.Plateswereincubatedat30oCfor2days.由圖4.1可知，與野生型菌株相比，ACE2的缺失突變菌株顯示出較高的乙醇耐受性，而RSC1的

山東理工大學碩士學位論文第五章五升發(fā)酵罐的小試實驗28第五章五升發(fā)酵罐的小試實驗5.1發(fā)酵培養(yǎng)基的小試實驗通過搖瓶實驗，共發(fā)現10個對乙醇生物合成負調控的轉錄因子。為進一步探討這些轉錄因子基因的單基因缺失菌株在工業(yè)發(fā)酵應用中的潛在能力，本實驗采用與搖瓶發(fā)酵一致的控制條件，通過容量為5升的小型發(fā)酵罐進行了小試實驗。發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為3.5升，接種量為1%，發(fā)酵罐溫度設定為30℃。有氧發(fā)酵階段，發(fā)酵罐內的攪拌轉數設定為220rpm，通氣量3L/min。8小時后，調節(jié)轉速為150rpm，開始低轉速發(fā)酵。分別于接種后的24小時、48小時和72小時三個時間點取樣，檢測發(fā)酵液中的葡萄糖和乙醇含量。結果如圖5.1和圖5.2所示。圖5.1發(fā)酵24h、48h和72h三個時間點的葡萄糖濃度Fig.5.1Glucoseconcentrationatthreetimepointsoffermentationat24h,48hand72h由圖5.1可知，與對照野生型菌株相比，除INO2基因的缺失株在三個取樣時間點測得的葡萄糖含量與對照野生型菌株相似外，其余單基因缺失株測得的葡萄糖濃度均低于對照野生型菌株。其中，ACE2、SPT10和SWI4基因缺失株在三個取樣點的葡萄糖濃度均降低較多，說明這三個基因缺失株可有效提高葡萄糖的利用效率，具有提高乙醇產率的潛力。ACE2基因缺失株在24小時測得的葡萄糖濃度為76g/L，較對照野生型菌株降低了18.3%，在48小時測得的葡萄糖濃度為54g/L，較對照野生型菌株降低了37.2%，在72小時測得的葡萄糖濃度為36.3g/L，較對照野生型菌株降低了54%；SPT10基因缺失株在24小時測得的葡萄糖濃度為80.2g/L，較對照野生型菌株降低了13.8%，在48小時測得的葡萄糖濃度為55.2g/L，較對照野生型菌株降低了35.8%，在72小時測得的葡萄糖濃度為36.8g/L，較對照野生型菌株降低了53.4%；

【參考文獻】：
期刊論文
[1]生物傳感器法快速測定酒中的乙醇含量[J]. 馮東,王丙蓮,梁曉輝,李雪梅,李大海.  釀酒科技. 2012(02)
[2]生物傳感器的應用研究進展[J]. 武寶利,張國梅,高春光,雙少敏.  中國生物工程雜志. 2004(07)



本文編號：3570020