發(fā)布時間：2021-11-25 16:56

　　溶菌酶,又稱N-乙酰胞壁質(zhì)肽聚糖水解酶,是一種無害、無毒,不會殘留在體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)。其廣泛分布于不同生物體中,是一種能水解微生物細胞壁黏多糖的堿性水解酶。2007年,本實驗室首次分離和鑒定了海參i-型溶菌酶基因,并已在原核細胞和真核細胞中高效表達其目的蛋白。該研究以本實驗室已構(gòu)建的能高效表達的海參i-型溶菌酶的畢赤酵母基因工程菌HS3-1為發(fā)酵出發(fā)菌株,運用發(fā)酵罐對該工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵液經(jīng)過一系列分離純化后得到海參i-型溶菌酶產(chǎn)品。利用高效液相色譜和MALDI-TOF質(zhì)譜技術對海參i-型溶菌酶產(chǎn)品進行分析測定,通過利用分子動力學模擬的方法對該酶熱穩(wěn)定性進一步研究。研究結(jié)果如下:（1）5 L發(fā)酵罐初始為3 L BSM基礎鹽培養(yǎng)基,發(fā)酵過程控制條件為溫度30℃,pH6.0,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min,溶解氧DO 30%;發(fā)酵過程分為三個階段,即細胞生長階段、甘油流加階段和甲醇誘導產(chǎn)物分泌階段。發(fā)酵結(jié)束后,分析該發(fā)酵液的溶菌酶產(chǎn)量為58mg/L。最后生產(chǎn)的海參i-型溶菌酶產(chǎn)品,其酶活力為1246 U/mg。高效液相色譜分析結(jié)果顯示,該溶菌酶產(chǎn)品與蛋清溶菌酶標準品的出峰時間相同,而且無... 

【文章來源】：大連工業(yè)大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

溶菌酶的催化機制Fig.1-1Thecatalyticmechanismoflysozyme

第三章結(jié)果與討論26圖3-2中可以看出，該圖為發(fā)酵工藝參數(shù)控制圖，在整個發(fā)酵過程中溫度和pH隨著發(fā)酵的進行，一直維持在設定值上下浮動，說明其比較穩(wěn)定。在細胞生長階段，因細胞生長繁殖需要進行大量溶解氧，這時可以通過提高通氣量和額外補充氧氣的方式來維持溶氧。發(fā)酵過程中溶解氧的變化是一個十分重要的參數(shù)，它的變化可以更加精準控制發(fā)酵，從而保障了整個發(fā)酵的順利進行。圖3-2發(fā)酵工藝參數(shù)控制圖Fig.3-2Fermentationprocessparametercontrolchart3.1.2發(fā)酵過程中菌體量及酶活力檢測在發(fā)酵初始階段，測得細胞菌體濕重為61g/L。隨著發(fā)酵進行到36h，此時細胞菌體積累量達到180-220g/L，細胞積累量達到穩(wěn)定。接著加入甲醇進行誘導發(fā)酵，開始有海參i-型溶菌酶產(chǎn)生。從圖3-3可以看出，0-26h為種子液接入發(fā)酵罐內(nèi)細胞菌體大量積累。26-36h溶解氧突升到90%以上，開始對發(fā)酵液補充流加甘油培養(yǎng)基，使細胞菌體量進一步積累。36-132h在線監(jiān)測控制發(fā)酵液甲醇濃度1%左右，海參i-型溶菌酶逐漸積累，酶活力最高到達600U/mL。而132h后溶菌酶酶活力不再增加，即發(fā)酵結(jié)束。

第三章結(jié)果與討論27圖3-3酶活力及菌體濕重變化Fig.3-3Thechangesofenzymeactivityandwetcellweight3.1.3不同時期誘導產(chǎn)物的SDS-PAGE分析對上述發(fā)酵過程各個時期進行取樣，利用SDS-PAGE電泳分析其溶菌酶積累趨勢。從圖3-4中可以看出，1泳道為誘導0h時，無海參i-型溶菌酶產(chǎn)生；2泳道為誘導12h時，開始產(chǎn)生溶菌酶。隨著甲醇誘導時間的遷移，溶菌酶的表達量也隨著不斷增加，在誘導96h時蛋白表達量達到了最大。進一步將圖3-4中目蛋白表達條帶使用Bandscan軟件進行占比分析，結(jié)果顯示誘導96h的目的蛋白含量在67.8%。

【參考文獻】：
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