桿狀病毒是一類專職感染無脊椎動物的病毒,目前表達(dá)載體和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。研究在桿狀病毒Bac-to-Bac操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上將桿狀病毒載體改造成能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因的載體。首先,將Bac-to-Bac操作系統(tǒng)中pFastBac-Dual質(zhì)粒中的PH和p10啟動子替換成巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子和真核生物延伸因子（EF1）基因的啟動子;然后將egfp基因和mCherry基因分別插入到EFI啟動子和CMV啟動子下游;通過轉(zhuǎn)座獲得表達(dá)egfp和mCherry基因的重組桿狀病毒基因組,并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒。重組桿狀病毒可以在昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光和紅色熒光,表明以CMV啟動子和EF1啟動子構(gòu)建的重組桿狀病毒既可以在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因,又可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因。該載體可以應(yīng)用于特殊蛋白的真核表達(dá)和基因治療藥物的研究開發(fā)。 

【文章來源】：湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,59(23)

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【部分圖文】：

Donor質(zhì)粒構(gòu)建流程

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增出來的片段PCMV和PEF1大小分別位于250～500 bp和500～750 bp，與片段預(yù)期的大小（分別為375和574 bp）相符。再通過Overlapping PCR將PCMV和PEF1融合在一起獲得大小為750～1 000 bp的片段PCMV-PEF1（圖2A），大小與預(yù)期大�。�946 bp）相符。將PCMV-PEF1插入到p FastBac-Dual質(zhì)粒的Xho I和Eco R I酶切位點(diǎn)后，獲得改造的donor質(zhì)粒p Fast Bac-2EP，質(zhì)粒PCR鑒定和酶切鑒定結(jié)果（圖2B和圖2C）均表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。進(jìn)一步將質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明插入片段沒有發(fā)生點(diǎn)突變。因此該donor質(zhì)�？捎糜谙掠卧囼�(yàn)。2.2 質(zhì)粒p Fast Bac-2EP-m Cherry-egfp的構(gòu)建

根據(jù)所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增m Cherry和egfp基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到711和729 bp的兩條條帶（圖3A），條帶大小與預(yù)期相符。將目的片段m Cherry和egfp片段通過酶切連接的方法分別插入PCMV和PEF1下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Xho I和Sph I以及Eco R I和Xba I分別對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，表明酶切樣品均能產(chǎn)生2條條帶（圖3B），大小與預(yù)期結(jié)果相符合。將鑒定正確的質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果顯示插入序列沒有發(fā)生突變，表明p Fast Bac-2EP-m Cherry-egfp構(gòu)建成功。2.3 重組質(zhì)粒p Ac-2EP-m Cherry-egfp的構(gòu)建

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)研制疫苗的研究進(jìn)展[J]. 思越,朱一超,宋曦玉,羅亞妮,程林峰.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2020(08)
[2]Improving Baculovirus Transduction of Mammalian Cells by Incorporation of Thogotovirus Glycoproteins[J]. Liangbo Hu,Yimeng Li,Fei Deng,Zhihong Hu,Hualin Wang,Manli Wang.  Virologica Sinica. 2019(04)



本文編號：3465940