背景GABA是哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA受體也是臨床上重要的神經(jīng)活性化合物的主要靶點。GABAc受體是視網(wǎng)膜組織中關鍵的調(diào)節(jié)性受體,研究表明,激活的GABAC受體能夠抑制雙極神經(jīng)元與神經(jīng)節(jié)細胞之間的谷氨酸釋放,以此來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的動態(tài)變化。視網(wǎng)膜病變引起的視神經(jīng)疾病是眼科疾病中的急癥和重癥,對視網(wǎng)膜病變這一大類視神經(jīng)病變過程中的新靶標、新途徑的研究仍不全面。本研究應用小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC-5）成功構建GABAc受體Rho2基因（GABRR2）過表達及敲除細胞系,建立了GABAC離子通道結(jié)構及功能篩選平臺,為體外闡述GABAC受體結(jié)構功能以及受體同藥物的相互作用奠定基礎,以期為疾病干預和藥物設計提供新靶標和新思路。目的構建GABRR2基因過表達穩(wěn)定細胞系以及GABRR2基因敲除細胞系,研究基因編輯后的雙倍體成體細胞詳細的基因型與表現(xiàn)型,以及基因編輯對GABRR2基因外顯子剪切的作用。方法（1）分別以pCMV6-Entry-mRho2以及p IRES-e GFP表達質(zhì)粒為模板,通過快速克隆法構建質(zhì)粒,利用Lipo6000^TM轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染... 

【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PCR凝膠電泳圖

A. M: DNAmarker; 1: Identification of PCR products of pIRES-eGFP;B. M: DNAmarker; 2: Identification of PCR products of mRho2;C. M: DNAmarker; 2:Identification of colony PCR of positive clone ;1.3.4: Identification of colony PCR of negative clones.ABRR2 基因過表達穩(wěn)定細胞系的構建用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑將pIRES2-eGFP-mRho2重組質(zhì)粒導入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)C-5 中，轉(zhuǎn)染 48 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，再利用有限稀釋法進行選，篩選出單克隆細胞，擴大培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定表達 GABRR2 的細胞系，為 GABRR2 過表達細胞系。以野生型 RGC-5 細胞作為陰性對照，在倒置熒下進行觀察，野生型 RGC-5 細胞無熒光（圖 1-2-A），而過表達細胞系可清到存在較強綠色熒光（圖 1-2-B），表明重組 mRho2 質(zhì)粒已在 RGC-5 細胞達。

A: 野生型 RGC-5 細胞系明視野；B：野生型 RGC-5 細胞熒光視野；C: 過表達 RGC-5 細胞系明視野；D：過表達 RGC-5 細胞系熒光視野Fig 1-2. The image of cells after transfection and selection(×200).A: Wild type cell line in bright field; B: Wild type cell line in fluorescence field;: Overexpression cell line in bright field; D:Overexpression cell line in fluorescence field.3 流式細胞術檢測穩(wěn)定表達 GABRR2 的 RGC-5 細胞數(shù)量流式細胞儀檢測 GABRR2 過表達細胞系中 GFP 陽性細胞數(shù)量。以野生型 RGC-5 胞 作 為 陰 性 對 照 ， 結(jié) 果 顯 示 在 收 集 的 1×104個 細 胞 中 ， 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染RES2-eGFP-mRho2 質(zhì)粒的 RGC-5 細胞中 GFP 陽性細胞占 97%，而野生型 RGC-5胞中 GFP 陽性細胞比例為 0。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)



本文編號：3363625