為了探究3-酮脂酰-CoA合酶（KCS酶）對于小球藻脂肪酸代謝過程的調(diào)控作用,增加超長鏈不飽和脂肪酸的含量,本文采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將碎米薺KCS酶基因轉(zhuǎn)入過表達硬脂酰載體蛋白去飽和酶（SAD酶）基因的改造蛋白核小球藻中,觀察外源基因的轉(zhuǎn)入對小球藻脂肪酸合成的影響。實驗以pCAMBIA1301質(zhì)粒為載體轉(zhuǎn)化KCS基因,通過潮霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化藻,用相同質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化GUS基因觀察小球藻對所用表達盒的表達能力,采用PCR和RT-PCR驗證碎米薺KCS酶基因陽性轉(zhuǎn)化藻,利用高效液相色譜（HPLC）分析脂肪酸合成代謝中間產(chǎn)物,用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法對其分析小球藻脂肪酸組成。本文所完成的基因轉(zhuǎn)化是在前期完成了SAD基因轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行的二次轉(zhuǎn)化,首次獲得了同時轉(zhuǎn)化了SAD酶基因與KCS酶基因的蛋白核小球藻,并探究了KCS酶對小球藻脂肪酸合成的影響,為深入探究小球藻脂肪酸代謝的調(diào)控機理提供了研究參考。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:（1）成功構(gòu)建了以雙元載體pCAMBIA1301為基礎(chǔ),通過敲除GUS基因,連入碎米薺KCS基因改造而成的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-KCS... 

【文章來源】：廣東海洋大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pCAMBIA1301載體圖

膠上的電泳產(chǎn)物進行回收。.3.4 基因連接利用 T4 連接酶試劑盒，將經(jīng)過 BglII 和 BsteII 雙酶切的 pCAMBIA1301 線段和外源 KCS 基因進行連接，用外源 KCS 基因取代 GUS 基因所在位置，重組質(zhì)粒（見圖 3-2），操作步驟參照試劑盒說明書，反應(yīng)體系見表 2-3，反應(yīng)。表 2-3 連接反應(yīng)體系Tab 2-3 Reaction system of ligation組分 20μl 反應(yīng)體系載體 DNA+目的片段 9μL10×Ligation Buffer 1μlT4 DNA Ligase,5U/μl 0.5μl滅菌 dd H2O 加至 10μL

廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文討論PCR 鑒定抗性平板上挑取的重組質(zhì)粒 pCAMBIA1301-KCS 陽性轉(zhuǎn)化子定，結(jié)果見圖 2-3。示，泳道 6 為野生大腸桿菌的 PCR 產(chǎn)物，作為陰性對照，泳的菌落 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中除陰性對照外皆出現(xiàn)了條帶近，擴增片段為 116bp，與預(yù)期相符合。由 PCR 結(jié)果可知，外轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，即轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌細胞內(nèi)的是構(gòu)建成功BIA1301-KCS。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3352121