發(fā)布時(shí)間：2017-04-27 13:09

  本文關(guān)鍵詞：灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的建立及BcATM1基因的致病功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：灰霉病(gray mold)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的真菌病害,以雙子葉植物為主,可在200多種植物上發(fā)生,在果蔬保護(hù)地生產(chǎn)中,灰霉病已經(jīng)成為主要病害,據(jù)報(bào)道,世界上每年因該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100-1000億美元。該病害的病原菌為灰葡萄孢(Botrytis cinerea),屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)真菌�；移咸焰呤堑湫偷乃荔w營(yíng)養(yǎng)型病原真菌,研究表明,灰葡萄孢可產(chǎn)生多種致病因子參與致病過(guò)程,主要包括細(xì)胞壁降解酶類、角質(zhì)酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反應(yīng)的酶類、小RNA及小分子物質(zhì)等。但是,對(duì)灰葡萄孢侵染植物的致病機(jī)制仍研究很少,對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究,鑒定灰葡萄孢致病相關(guān)基因,不僅有助于揭示灰葡萄孢這種死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌致病的分子機(jī)制,還有可能從中發(fā)現(xiàn)可以作為殺真菌劑作用靶標(biāo)的蛋白因子,為開(kāi)發(fā)防治灰霉病及其它類似病害的高效藥劑奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。本論文采用正向遺傳學(xué)研究策略,在優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法提高轉(zhuǎn)化效率至80-100/105個(gè)分生孢子基礎(chǔ)上,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(ATMT),構(gòu)建了一個(gè)包含12000個(gè)轉(zhuǎn)化子的T-DNA隨機(jī)插入群體,并采用離體葉片接種法,對(duì)其進(jìn)行致病力檢測(cè),從中篩選出了463個(gè)致病力發(fā)生異常的突變體。通過(guò)southern blot檢測(cè),該突變體庫(kù)中T-DNA隨機(jī)插入灰葡萄孢基因組的單拷貝率達(dá)到了53.8%,這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中大規(guī)模鑒定灰葡萄孢致病相關(guān)基因提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過(guò)侵染不同的寄主植物,本論文還篩選到了23個(gè)突變體具有寄主侵染特異性�；趯�(duì)上述突變體庫(kù)的T-DNA插入位點(diǎn)分析,篩選到一株致病力缺陷突變體,其T-DNA插在ATM1同源基因終止密碼子下游169bp處,將該基因命名為Bc ATM1。Atm1是一類在真核生物中進(jìn)化保守的線粒體內(nèi)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在維持細(xì)胞正常生命過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,但Atm1在病原菌致病過(guò)程的作用至今仍不清楚。本研究為了驗(yàn)證其功能,通過(guò)反向遺傳學(xué)策略,采用同源替換的方法對(duì)該基因?qū)嵤┝硕c(diǎn)敲除。表型分析發(fā)現(xiàn),突變體ΔBcatm1的分生孢子萌發(fā)緩慢且不同步,菌絲生長(zhǎng)速度也顯著慢于野生型;離體葉片接種實(shí)驗(yàn)顯示,突變體ΔBcatm1基本喪失了致病能力,在侵入寄主細(xì)胞后,只能在接種點(diǎn)附近引發(fā)微小的病斑,但不擴(kuò)展。將完整的Bc ATM1基因重新導(dǎo)入突變體ΔBcatm1可以完全或部分恢復(fù)上述異常表型。表明Bc ATM1是一個(gè)關(guān)鍵的致病相關(guān)基因,參與了灰葡萄孢分生孢子的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)及侵染寄主等過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：灰葡萄孢 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 突變體庫(kù) ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 致病力
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.44
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 1.1 植物灰霉病與灰葡萄孢12-15
• 1.1.1 植物灰霉病12-13
• 1.1.2 灰葡萄孢生物學(xué)分類13
• 1.1.3 灰葡萄孢的侵染循環(huán)13-14
• 1.1.4 灰葡萄孢的侵染途徑14-15
• 1.2 灰葡萄孢致病功能基因組學(xué)研究進(jìn)展15-16
• 1.3 ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.4 目的和意義17-18
• 第二章 灰葡萄孢突變體庫(kù)的建立18-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-22
• 2.1.1 供試菌株18
• 2.1.2 植物材料18
• 2.1.3 供試載體18
• 2.1.4 主要儀器和設(shè)備18-19
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑19
• 2.1.6 培養(yǎng)基19-21
• 2.1.7 引物21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-36
• 2.2.1 基因組DNA提取22-24
• 2.2.2 PCR反應(yīng)24-26
• 2.2.3 酶切反應(yīng)26
• 2.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2.5 雙元載體pBHt2轉(zhuǎn)化27
• 2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的灰葡萄孢T-DNA隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子群體的建立27-29
• 2.2.7 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的建立29-31
• 2.2.8 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的評(píng)價(jià)31-35
• 2.2.9 T-DNA插入位點(diǎn)的克隆35-36
• 2.3 結(jié)果與分析36-44
• 2.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的灰葡萄孢T-DNA隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子群體的建立36-37
• 2.3.2 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的構(gòu)建37-38
• 2.3.3 灰葡萄孢致病力缺陷突變體的寄主特異性檢測(cè)38-39
• 2.3.4 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)39-41
• 2.3.5 灰葡萄孢突變體T-DNA插入位點(diǎn)鑒定41-44
• 第三章 灰葡萄孢ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BcATM1的功能分析44-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料44-46
• 3.1.1 供試菌株44
• 3.1.2 植物材料44
• 3.1.3 供試載體44
• 3.1.4 轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基44-45
• 3.1.5 引物45-46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法46-54
• 3.2.1 質(zhì)粒DNA提取46-47
• 3.2.2 連接反應(yīng)47
• 3.2.3 重組反應(yīng)47-48
• 3.2.4 大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化48-49
• 3.2.5 目的基因的序列分析49-50
• 3.2.6 基因缺失突變體的構(gòu)建50-51
• 3.2.7 基因互補(bǔ)突變體的構(gòu)建51-53
• 3.2.8 突變體鑒定53
• 3.2.9 目的基因的生物功能分析53-54
• 3.3 結(jié)果與分析54-61
• 3.3.1 致病相關(guān)基因BcATM1的鑒定及特征分析54-55
• 3.3.2 BcATM1基因的敲除載體的構(gòu)建55-56
• 3.3.3 BcATM1基因的互補(bǔ)載體的構(gòu)建56-57
• 3.3.4 BcATM1的突變體的分子鑒定57-58
• 3.3.5 BcATM1基因參與灰葡萄孢孢子萌發(fā)以及菌絲生長(zhǎng)分析58-59
• 3.3.6 BcATM1基因參與灰葡萄孢侵染寄主植物分析59-61
• 第四章 結(jié)論61-63
• 展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 作者簡(jiǎn)介67-68
• 致謝68-69

【相似文獻(xiàn)】

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2 陶嵐;灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的建立及BcATM1基因的致病功能研究[D];吉林大學(xué);2016年

3 董玉霞;灰葡萄孢除草相關(guān)基因的克隆與功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

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7 馬娟;灰葡萄孢除草活性菌株的誘變及其相關(guān)基因的差異顯示[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 賈嬌;灰葡萄孢鈣調(diào)磷酸酶基因β亞基及其啟動(dòng)子的克隆與序列分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 熊云;灰葡萄孢BC1G_08931基因的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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  本文關(guān)鍵詞：灰葡萄孢致病缺陷突變體庫(kù)的建立及BcATM1基因的致病功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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