本文關(guān)鍵詞：NSun2基因敲除的小鼠胚胎干細(xì)胞系和小鼠模型的建立及基因功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ESC)取自于著床前的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),具有無(wú)限增殖的自我更新能力和分化為包括生殖系在內(nèi)的機(jī)體全部類(lèi)型組織細(xì)胞的全能性。在一定的體外培養(yǎng)條件下,胚胎干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞、胰島p細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種類(lèi)型的體細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞全能性的特點(diǎn),使其不僅為研究機(jī)體的發(fā)育機(jī)制和基因功能提供了良好的平臺(tái),也在細(xì)胞替代治療等新興疾病治療手段中具有廣闊的應(yīng)用前景。哺乳動(dòng)物在生物進(jìn)化程度上更加接近于人類(lèi),是研究基因功能和疾病致病機(jī)理的良好模型。哺乳動(dòng)物疾病模型,如嚙齒類(lèi)的小鼠、大鼠疾病模型,豬的疾病模型和非人靈長(zhǎng)類(lèi)的猴子模型等,在對(duì)基因的功能和作用機(jī)制的探索、新藥研發(fā)及人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)理的研究和治療等方面發(fā)揮著非常重要的作用。要獲得遺傳修飾的哺乳動(dòng)物疾病模型需要同時(shí)具備以下兩個(gè)因素：一方面是對(duì)遺傳物質(zhì)基因組DNA進(jìn)行遺傳修飾,常見(jiàn)的技術(shù)包括物理、化學(xué)和病毒或者質(zhì)粒介導(dǎo)的隨機(jī)插入、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的基因捕獲、同源重組和位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯等；二是將遺傳修飾拓展到個(gè)體水平并能夠通過(guò)生殖系傳遞到下一代,常見(jiàn)的技術(shù)包括胚胎原核注射、體細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的生殖系嵌合以及單倍體胚胎干細(xì)胞替代精子與卵母細(xì)胞融合產(chǎn)生個(gè)體等。近幾年發(fā)展起來(lái)的位點(diǎn)特異性核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù),是一種定向改造基因組的遺傳修飾技術(shù),是進(jìn)行基因組改造和探索基因功能的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。目前常用的基因編輯技術(shù)主要包括ZFN (Zinc-finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9。其中CRISPR-Cas9技術(shù)由于構(gòu)建簡(jiǎn)單、使用方便、周期短、基因編輯效率高而且價(jià)格便宜,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因修飾的干細(xì)胞系的建立和哺乳動(dòng)物疾病模型的獲得。其主要原理是通過(guò)gRNA利用堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向目的位點(diǎn),引導(dǎo)Cas9在該位點(diǎn)進(jìn)行切割從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double strand break, DSB),進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)源性的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制,通過(guò)同源重組修復(fù)(Homologous directed repair, HDR)或非同源末端連接(Non-homologousend-joining NHEJ)將斷裂的雙鏈DNA連接起來(lái),通過(guò)不同的修復(fù)方式以及利用設(shè)計(jì)好的帶有同源區(qū)段的供體質(zhì)�；蚬押塑账崞�,就可以實(shí)現(xiàn)基因敲除、外源基因或片段的定點(diǎn)插入、基因特定位點(diǎn)的定點(diǎn)突變以及染色體的大片段缺失和重排等遺傳修飾。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,NSun2基因是一種RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶,能夠在tRNA的胞嘧啶第5位的C原子上進(jìn)行甲基化修飾(5mC),促進(jìn)tRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的生物合成,并能夠抑制Myc基因誘導(dǎo)的腫瘤增殖,對(duì)精子發(fā)生也具有非常重要的作用。另有報(bào)道稱(chēng)NSun2基因異常會(huì)產(chǎn)生常染色體隱性的智力障礙。MRNA的甲基化修飾主要發(fā)生在腺苷酸第6位的N原子上(m6A),m6A修飾對(duì)mRNA的剪切,穩(wěn)定性,細(xì)胞內(nèi)的定位,翻譯等具有非常重要的作用。因而我們推測(cè)mRNA的m5C修飾也可能具有非常類(lèi)似的功能,研究NSun2對(duì)mRNA的5mC甲基化修飾的作用將有助于我們弄清楚NSun2基因發(fā)揮功能的分子機(jī)制。為此我們利用CRISPR技術(shù)建立了NSun2基因純合敲除的胚胎干細(xì)胞(ESC)和小鼠動(dòng)物模型,為后續(xù)的基因功能和分子機(jī)制的的探索、胚胎干細(xì)胞的重編程以及對(duì)小鼠的發(fā)育和代謝等研究提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CRISPR 疾病模型 胚胎干細(xì)胞 NSun2 RNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1.1 胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展12-13
• 1.1.1 胚胎干細(xì)胞的獲得和應(yīng)用12
• 1.1.2 體細(xì)胞重編程為干細(xì)胞12-13
• 1.2 遺傳修飾技術(shù)在哺乳動(dòng)物疾病模型建立中的研究進(jìn)展13-22
• 1.2.1 傳統(tǒng)的遺傳修飾技術(shù)14-15
• 1.2.2 基因編輯技術(shù)15-22
• 1.3 RNA甲基化和NSun2基因功能研究進(jìn)展22-25
• 1.3.1 m6A的研究進(jìn)展22-24
• 1.3.2 NSun2基因功能研究進(jìn)展24-25
• 1.4 本研究的目的和意義25-26
• 第二章 NSun2基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立和功能的初步研究26-46
• 2.1 材料和方法26-38
• 2.1.1 主要溶液配制26
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備26-27
• 2.1.3 主要試劑和耗材27-28
• 2.1.4 小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立28-30
• 2.1.5 NSun2基因敲除打靶策略30
• 2.1.6 NSun2基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建和獲得30-33
• 2.1.7 篩選高效的sgRNA33
• 2.1.8 NSun2基因打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞33-34
• 2.1.9 流式細(xì)胞儀分選34
• 2.1.10 挑取單克隆細(xì)胞系34
• 2.1.11 NSun2基因敲除胚胎干細(xì)胞基因型鑒定34-36
• 2.1.12 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞Western blot鑒定36-37
• 2.1.13 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞系表型分析37-38
• 2.2 結(jié)果及分析38-43
• 2.2.1 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞系的建立38-39
• 2.2.2 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞系基因型鑒定結(jié)果39-40
• 2.2.3 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞系Western Blot鑒定結(jié)果40-41
• 2.2.4 NSun2基因敲除的胚胎干細(xì)胞系表型分析結(jié)果41-43
• 2.3 討論43-45
• 2.4 結(jié)論45-46
• 第三章 建立NSun2基因敲除的小鼠模型46-58
• 3.1 材料與方法46-51
• 3.1.1 主要溶液配制46
• 3.1.2 主要儀器與設(shè)備46
• 3.1.3 主要試劑與耗材46
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46
• 3.1.5 NSun2基因敲除打靶策略46-47
• 3.1.6 NSun2基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建和獲得47
• 3.1.7 體外轉(zhuǎn)錄Cas9和sgRNA47-49
• 3.1.8 胚胎胞質(zhì)注射獲得F0代founder鼠49
• 3.1.9 F1代NSun2基因雜合敲除小鼠的獲得49-50
• 3.1.10 F2代NSun2基因純合敲除小鼠的獲得50-51
• 3.2 結(jié)果與分析51-56
• 3.2.1 獲得注射用的Cas9 RNA和sgRNA51
• 3.2.2 F0代founder鼠的獲得和基因型鑒定51-52
• 3.2.3 F1代NSun2基因敲除小鼠的獲得和基因型鑒定52
• 3.2.4 F2代NSun2基因敲除小鼠的獲得和基因型鑒定52-53
• 3.2.5 F2代NSun2基因敲除小鼠Western Blot鑒定53-54
• 3.2.6 NSun2基因敲除小鼠的表型54-56
• 3.3 討論56-57
• 3.4 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 附錄63-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文72

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李兆忠;美一研究所將停止利用胚胎獲取干細(xì)胞[J];世界科學(xué);2002年03期

2 ;美科學(xué)家用人體胚胎干細(xì)胞培育出血管[J];世界科技研究與發(fā)展;2002年03期

3 張學(xué)明;法美聯(lián)手從胚胎干細(xì)胞首次培育出生殖細(xì)胞[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年04期

4 ;法科學(xué)家首次用胚胎干細(xì)胞培育出生殖細(xì)胞[J];世界科技研究與發(fā)展;2003年03期

5 ;日本首次培育出人體胚胎干細(xì)胞[J];世界科技研究與發(fā)展;2003年04期

6 ;胚胎干細(xì)胞[J];生命世界;2005年11期

7 ;胚胎干細(xì)胞與胚胎生殖細(xì)胞[J];生物技術(shù)通報(bào);2005年02期

8 李瀟;;創(chuàng)建干細(xì)胞而不損傷正常胚胎[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2006年07期

9 王靜舒;;胚胎干細(xì)胞[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2006年10期

10 張樹(shù)庸;;美公司宣布成功克隆人體胚胎——使制造患者匹配型干細(xì)胞成為可能[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2008年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 付強(qiáng);王珂;王常勇;;心肌方向分化和富集對(duì)胚胎干細(xì)胞在心肌缺血部位移植后致腫瘤能力的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

2 趙惠萍;王綺如;;骨髓內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的造血分化[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)新世紀(jì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2002年

3 姚玲玲;朱依純;;胚胎干細(xì)胞分化潛能研究進(jìn)展[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)論文匯編2004年第二期[C];2004年

4 黃華容;徐超;趙小立;陳良標(biāo);張銘;;誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成平滑肌的研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

5 王樹(shù)玉;張軍;任國(guó)慶;;胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展[A];第五屆全國(guó)優(yōu)生科學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2000年

6 印惠s

本文編號(hào)：330481