本文關(guān)鍵詞：大葉落地生根KdSOC1基因的克隆與功能的初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大葉落地生根(Kalanchoe daigremontiana),為景天科伽藍菜屬多年生草本植物,葉緣所形成的胎生苗是無性繁殖的方式,是典型的植物體細胞全能性的體現(xiàn),即葉緣體細胞直接通過分化形成新個體。然而針對這種極為特殊的無性繁殖方式,迄今沒有研究闡明胎生苗形成過程所涉及的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在實驗室前人構(gòu)建的落地生根cDNA文庫中,發(fā)現(xiàn)一個與擬南芥SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)基因同源的EST序列(contig1019)。本研究通過RACE和Genome Walking技術(shù)克隆了KdSOC1基因cDNA全長和啟動子,進行了相關(guān)生物信息學分析,探究了該基因的表達模式并構(gòu)建了大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系及愈傷組織誘導體系,為后期深入研究KdSOC1基因功能奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下：1通過RACE技術(shù)獲得KdSOC1基因cDNA全長為1410bp,BLAST比對發(fā)現(xiàn)與山核桃SOC1基因同源性相似度達70%,故而命名為KdSOC1基因。其ORF全長為684bp,編碼227個氨基酸,CDS具有保守區(qū)域MADS-MEF2-like和K-bcx,屬于植物MADS Ⅱ型基因。2通過Genome Walking技術(shù)獲得KdSOC1啟動子序列為1401bp,進行順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)該基因具有ABRE (ABA作用元件)、CGTCA-motif (MeJA作用元件)、GARE-motif(GA作用元件)、TCA-element (SA作用元件)、rbcS-CMA7a(光響應(yīng)作用元件)、TATA-box (核心轉(zhuǎn)錄起始單元)、CAA-box(轉(zhuǎn)錄起始單元)。說明該基因受到多種激素信號的調(diào)節(jié),同時參與多個代謝反應(yīng)。3在啟動子順式作用元件預測基礎(chǔ)上,結(jié)合實時熒光定量PCR和半定量RT-PCR技術(shù)分析了該基因在激素(ABA、SA、GA、MeJA)誘導下及不同環(huán)境(自然干旱和長短日照)下的表達模式。激素誘導結(jié)果表明,KdSOC1基因?qū)BA、GA、MeJA和SA激素均有響應(yīng),而對SA和GA響應(yīng)顯著且持久。不同光周期誘導結(jié)果顯示,LD誘導下,植物葉片中KdSOC1基因的表達水平高于SD誘導下的表達量；LD誘導下,KdSOC1基因的表達量急速增加,培養(yǎng)37天時該基因的表達量相對于28天時增加了約10倍,同時伴隨胎生苗的快速產(chǎn)生。自然干旱結(jié)果顯示,隨著干旱程度的加深,KdSOC1基因的表達量逐漸增多,輕度干旱時基因的表達水平高于CK1,而中度、重度干旱時基因的表達水平低于CK2-3,此現(xiàn)象與植株產(chǎn)生胎生苗的情況一致。因此,KdSOC1基因能感知和傳遞環(huán)境刺激信號并參與胎生苗的形成。4本研究構(gòu)建了過表達載體pBIN438-ORF KdSOCI、RNA干擾載體pZH01-AS ORF KdSOC1-GUS-S ORFKdSOC1及啟動子載體pBI121-PromoterKedSOC1-GUS載體,并以pBI438載體(NPTⅡ作為篩選標記基因)初步成功構(gòu)建了落地生根轉(zhuǎn)化體系,為深入研究該基因的功能及其對胎生苗形成的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。5為創(chuàng)建胎生苗“體細胞”體外快速研究體系,本研究初步建立高效、高質(zhì)量落地生根愈傷組織誘導體系,以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度6-BA與2,4-D對主莖段、幼嫩及成熟葉片三種外植體進行愈傷組織誘導。研究結(jié)果表明,主莖段最佳愈傷誘導激素濃度比例為0.5mg/L 6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為55.56%；幼嫩葉片最佳愈傷誘導激素濃度比例為lmg/L 6-BA:1.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為29.92%；成熟葉片最佳愈傷誘導激素濃度比例為2.5mg/L6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為43.07%。因此主莖段與成熟葉片均為誘導大葉落地生根愈傷組織形成的理想材料。
【關(guān)鍵詞】：大葉落地生根 胎生苗的形成 KdSOC1 表達分析 遺傳轉(zhuǎn)化
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞7-13
• 1 引言13-21
• 1.1 大葉落地生根胎生苗形成研究概況13-16
• 1.1.1 胎生苗的形成發(fā)育過程13-14
• 1.1.2 胎生苗的形成發(fā)育過程中相關(guān)基因與功能研究14-15
• 1.1.3 無性繁殖演變15-16
• 1.2 大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展16
• 1.3 SOC1基因的研究進展16-19
• 1.3.1 SOC1基因的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特征17
• 1.3.2 SOC1基因的表達調(diào)控17-18
• 1.3.3 SOC1基因的功能18-19
• 1.4 本研究目的內(nèi)容及技術(shù)路線19-21
• 1.4.1 研究背景19
• 1.4.2 研究目的19
• 1.4.3 研究內(nèi)容19-20
• 1.4.4 技術(shù)路線20-21
• 2 大葉落地生根KdSOC1基因cDNA的獲得及生物信息分析21-33
• 2.1 實驗材料21
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 主要酶與試劑21
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備21
• 2.1.4 常用培養(yǎng)基21
• 2.2 實驗方法21-27
• 2.2.1 大葉落地生根葉片總RNA的提取21
• 2.2.2 大葉落地生根cDNA的合成21-22
• 2.2.3 KdSOC1基因全長的獲得22-26
• 2.2.4 KdSOC1基因序列的生物學分析26-27
• 2.2.5 多重序列比對與系統(tǒng)進化分析27
• 2.3 結(jié)果與分析27-32
• 2.3.1 KdSOC1基因的克隆與序列分析27-28
• 2.3.2 KdSOC1蛋白序列分析及三級結(jié)構(gòu)預測28-30
• 2.3.3 同源性比較及系統(tǒng)進化分析30-32
• 2.4 討論32-33
• 3 大葉落地生根KdSOC1基因啟動子的克隆與分析33-40
• 3.1 實驗材料33
• 3.1.1 植物材料33
• 3.1.2 主要酶與試劑33
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備33
• 3.1.4 常用培養(yǎng)基33
• 3.2 實驗方法33-36
• 3.2.1 大葉落地生根DNA的提取33
• 3.2.2 KdSOC1基因啟動子的克隆33-36
• 3.2.3 生物信息學分析36
• 3.3 結(jié)果與分析36-39
• 3.3.1 大葉落地生根KdSOC1基因啟動子的克隆37
• 3.3.2 大葉落地生根KdSOC1基因啟動子序列分析37-39
• 3.4 討論39-40
• 4 大葉落地生根KdSOC1基因的表達分析40-48
• 4.1 實驗材料與處理40-41
• 4.1.1 實驗材料40
• 4.1.2 材料處理40-41
• 4.2 實驗方法41-42
• 4.2.1 不同處理下落地生根總RNA的提取及cDNA的合成41
• 4.2.2 實時熒光定量PCR41-42
• 4.2.3 半定量RT-PCR42
• 4.3 結(jié)果與分析42-45
• 4.3.1 KdSOC1基因在不同激素誘導下的表達分析42-43
• 4.3.2 KdSOC1基因在不同光周期下的表達分析43-44
• 4.3.3 干旱脅迫下KdSOC1基因的表達分析44-45
• 4.4 討論45-48
• 4.4.1 不同激素誘導下KdSOC1基因的表達分析45-46
• 4.4.2 不同光周期下KdSOC1基因的表達分析46
• 4.4.3 自然干旱處理下KdSOC1基因的表達分析46-48
• 5 大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建48-61
• 5.1 實驗材料48
• 5.1.1 植物材料48
• 5.1.2 載體與菌株48
• 5.1.3 主要酶與試劑48
• 5.1.4 主要儀器設(shè)備48
• 5.1.5 主要培養(yǎng)基48
• 5.2 實驗方法48-53
• 5.2.1 RNA的提取及cDNA的合成48-49
• 5.2.2 引物設(shè)計49
• 5.2.3 過表達載體pBIN438-ORF_(KdSOC1)的構(gòu)建49-51
• 5.2.4 干擾載體pZH01-AS ORF_(KdSOC1)-GUS-S ORF _(KdSOC1)的構(gòu)建51-52
• 5.2.5 啟動子載體pBI121-Promoter_(KdSOC1)-GUS的構(gòu)建52
• 5.2.6 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化及鑒定52
• 5.2.7 植物表達載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根52-53
• 5.2.8 主要儀器設(shè)備53
• 5.2.9 主要培養(yǎng)基53
• 5.3 結(jié)果與分析53-59
• 5.3.1 過表達載體的構(gòu)建53-54
• 5.3.2 干擾載體的構(gòu)建54
• 5.3.3 啟動子載體的構(gòu)建54-55
• 5.3.4 落地生根不同外植體的瞬時轉(zhuǎn)化效率55-56
• 5.3.5 參考Truesdale MR等建立的落地生根轉(zhuǎn)化體系56-57
• 5.3.6 類似于擬南芥花粉轉(zhuǎn)化法57
• 5.3.7 參考Garces等人建立的落地生根轉(zhuǎn)化體系57-59
• 5.4 討論59-61
• 5.4.1 落地生根轉(zhuǎn)化效率59
• 5.4.2 落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系59-61
• 6 大葉落地生根愈傷組織誘導體系的優(yōu)化61-73
• 6.1 實驗材料61
• 6.1.1 植物材料61
• 6.1.2 菌株與質(zhì)粒61
• 6.1.3 主要試劑61
• 6.1.4 主要儀器設(shè)備61
• 6.2 方法61-62
• 6.2.1 外植體處理61
• 6.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件61-62
• 6.2.3 愈傷組織誘導62
• 6.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析62
• 6.2.5 落地生根愈傷組織的瞬時轉(zhuǎn)化62
• 6.3 結(jié)果與分析62-71
• 6.3.1 不同外植體愈傷誘導效率62-64
• 6.3.2 植物激素配比對不同外植體愈傷組織誘導的影響64-69
• 6.3.3 不同外植體最佳愈傷誘導激素比例69-70
• 6.3.4 侵染時間對落地生根愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化的影響70-71
• 6.4 討論71-73
• 6.4.1 大葉落地生根愈傷組織誘導71
• 6.4.2 大葉落地生根愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化71-73
• 7 總結(jié)與展望73-75
• 7.1 總結(jié)73
• 7.2 展望73-75
• 參考文獻75-81
• 個人簡介81-82
• 導師簡介82-83
• 致謝83

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉建華;大葉落地生根是營養(yǎng)繁殖的好材料[J];生物學通報;2002年10期

2 游義霞;黃先忠;鄭銀英;崔百明;;大葉落地生根STM基因植物表達載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化[J];石河子大學學報(自然科學版);2012年03期

3 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王一U，

本文編號：328005