本文關(guān)鍵詞：MAZ基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的EMSA分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:MAZ參與細(xì)胞生理、病理狀態(tài)下多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,被調(diào)控的基因如基質(zhì)金屬蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A等與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟疾病、癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前研究報(bào)道多集中于MAZ介導(dǎo)下游基因的表達(dá)調(diào)控,而有關(guān)MAZ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究較少見。該基因的轉(zhuǎn)錄受到其啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控,多種轉(zhuǎn)錄因子參與其中。因此,本課題旨在通過對(duì)MAZ基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析,以發(fā)現(xiàn)潛在的轉(zhuǎn)錄因子順式反應(yīng)元件,并通過突變、競(jìng)爭(zhēng)及EMSA技術(shù)研究這些順式元件,為揭示MAZ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1.抽提細(xì)胞核蛋白:培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,收集細(xì)胞,使用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,并通過BCA法進(jìn)行蛋白定量。2.設(shè)計(jì)探針及生物素標(biāo)記:通過PROMO軟件分析MAZ基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游948 bp DNA序列潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)覆蓋該序列的探針,并進(jìn)行生物素標(biāo)記。3.EMSA試驗(yàn):標(biāo)記探針與核蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),電泳分析,轉(zhuǎn)膜及化學(xué)發(fā)光顯色。4.設(shè)計(jì)突變探針并進(jìn)行EMSA分析。5.使用明確的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性EMSA分析。結(jié)果:1.本試驗(yàn)研究的MAZ基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列可能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子有40種之多,設(shè)計(jì)的32條探針僅有11條出現(xiàn)明顯的DNA與蛋白結(jié)合條帶。2.突變探針的EMSA試驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)性EMSA分析結(jié)果顯示,MAZ基因啟動(dòng)子區(qū)距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-525~-504 nt的核酸序列可與轉(zhuǎn)錄因子Elk-1在體外相結(jié)合,其順式作用元件為CTTCCCCCA。結(jié)論:本課題通過PROMO軟件分析、EMSA試驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)性EMSA試驗(yàn),對(duì)人類MAZ基因SAF-1轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)上游(-948~-1)的啟動(dòng)區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置進(jìn)行了篩選。初步篩選檢出一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置,但尚需超遷移試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定;對(duì)于進(jìn)一步研究MAZ基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及EMSA技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：MAZ基因 PROMO EMSA 順式作用元件
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：D919
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表10-11
• 縮寫名詞附表11-12
• 前言12-14
• 1 材料14-17
• 1.1 主要儀器14
• 1.2 主要試劑及耗材14-15
• 1.3 主要配制試劑15-17
• 2 方法17-31
• 2.1 方法設(shè)計(jì)思路17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)流程17-18
• 2.3 THP-1 細(xì)胞的培養(yǎng)及核蛋白的提取18-20
• 2.3.1 THP-1 細(xì)胞的復(fù)蘇18-19
• 2.3.2 THP-1 細(xì)胞的換液與傳代培養(yǎng)19
• 2.3.3 THP-1 細(xì)胞的凍存19
• 2.3.4 THP-1 細(xì)胞核蛋白的提取19-20
• 2.3.5 BCA法測(cè)定核蛋白濃度20
• 2.4 MAZ啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及screen探針設(shè)計(jì)20-23
• 2.5 Screen probe的EMSA試驗(yàn)23-26
• 2.5.1 生物素標(biāo)記探針23
• 2.5.2 4.9%聚丙烯酰胺凝膠的制備23-24
• 2.5.3 EMSA結(jié)合反應(yīng)——探針與核蛋白的結(jié)合24
• 2.5.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析24-25
• 2.5.5 轉(zhuǎn)膜及紫外交聯(lián)25
• 2.5.6 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)生物素標(biāo)記探針25-26
• 2.6 突變探針的設(shè)計(jì)及EMSA實(shí)驗(yàn)26-29
• 2.7 競(jìng)爭(zhēng)性EMSA試驗(yàn)29-31
• 3 結(jié)果31-37
• 3.1 MAZ啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的軟件預(yù)測(cè)結(jié)果31-32
• 3.2 Screen probe的EMSA鑒定結(jié)果32-33
• 3.3 Mutant screen probe的EMSA鑒定結(jié)果33-34
• 3.4 Second mutant screen probe 15的EMSA鑒定結(jié)果34-35
• 3.5 Screen probe 15的競(jìng)爭(zhēng)性EMSA結(jié)果35-37
• 4 討論37-44
• 4.1 MAZ啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的EMSA鑒定結(jié)果37-40
• 4.2 EMSA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素40-42
• 4.3 EMSA技術(shù)的局限性42
• 4.4 PROMO對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)42-44
• 5 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述50-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-61
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

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