稻瘟病由病原真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起,是水稻三大病害之一,對(duì)水稻中抗稻瘟病基因功能的分析有助于揭示水稻抗稻瘟病的機(jī)制,加快水稻抗病育種進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室前期通過GWAS分析得到的一個(gè)與抗稻瘟病相關(guān)、編碼氧化還原酶的基因pi-G3,本文對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步研究。分別構(gòu)建了該基因CRISPR/Cas9敲除載體和超表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株利用打孔接種和ROS測(cè)定等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗病表型及相關(guān)生理生化指標(biāo)鑒定,同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位。初步證明了pi-G3參與水稻抗稻瘟病的功能。具體研究結(jié)果如下:1、設(shè)計(jì)pi-G3基因編輯靶點(diǎn)構(gòu)建CRISPR/Cas9載體pYB02-pi-G3,同時(shí)PCR擴(kuò)增pi-G3 CDS全長(zhǎng)構(gòu)建超表達(dá)載體pROXs-HA-pi-G3,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。2、對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行普通PCR測(cè)序以及熒光定量PCR鑒定pi-G3基因型及轉(zhuǎn)錄水平變化,獲得CRISPR突變體pi-G3-7-4,pi-G3-5-5;野生型:pi-G3-9-1;超表達(dá)植株:pi-G3-12-13,pi-G3-12-5。3、稻... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 稻瘟病對(duì)水稻的危害及防護(hù)措施
    1.2 植物抗病機(jī)制
    1.3 水稻抗稻瘟病研究進(jìn)展
    1.4 氧化還原酶參與植物抗病反應(yīng)
    1.5 生物信息學(xué)分析在水稻抗稻瘟病基因克隆研究中的應(yīng)用
    1.6 CRISPR系統(tǒng)在植物種的應(yīng)用
    1.7 目的和意義
第2章 候選基因的獲得及克隆
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 稻瘟菌小種,水稻材料,載體和菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
        2.1.5 抗生素使用濃度
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.0 稻瘟菌培養(yǎng)
        2.2.1 常用菌種保存
        2.2.2 水稻葉片cDNA獲得
        2.2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.2.4 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        2.2.5 超表達(dá)載體pROXs-HA載體構(gòu)建
        2.2.6 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
        2.2.7 原核表達(dá)載體構(gòu)建
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析
        2.3.1 候選基因的獲得
        2.3.2 載體的構(gòu)建及鑒定
    2.4 討論
第3章 pi-G3 功能初探
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 稻瘟菌生理小種,水稻轉(zhuǎn)基因材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        3.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 水稻葉片DNA提取
        3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.2.3 蛋白提取和Western blot檢測(cè)
        3.2.4 ROS檢測(cè)
        3.2.5 Punch打孔接種
        3.2.6 真菌生物量檢測(cè)
        3.2.7 潮霉素篩選
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析
        3.3.1 pi-G3 CRISPR敲除突變體及超表達(dá)材料鑒定
        3.3.2 pi-G3 CRISPR敲除突變體抗性表型鑒定
        3.3.3 pi-G3 超表達(dá)突變體抗性表型鑒定
        3.3.4 突變體常規(guī)表型鑒定
    3.4 討論
第4章 pi-G3 亞細(xì)胞定位以及原核表達(dá)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 水稻品種,載體
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        4.1.4 培養(yǎng)基以及試劑的主要成分及其配置方法
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 酶液配制
        4.2.2 原生質(zhì)體提取
        4.2.3 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程
        4.2.4 原核表達(dá)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 pi-G3 亞細(xì)胞定位
        4.3.2 pi-G3 原核表達(dá)
    4.4 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3018691