2020年,諾貝爾化學獎授予現就職于德國馬普感染生物學研究所的法籍科學家Emmanuelle Charpentier和美國加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna,表彰她們發(fā)明CRISPR基因編輯方法.她們揭示了Cas9具有RNA介導的DNA核酸內切酶活性,可以切斷任意DNA雙鏈,產生雙鏈斷裂.她們指出CRISPR具有在活細胞中修改基因的作用,利用CRISPR-Cas9編輯工具,可以精確改變細胞中的DNA.由于簡單、高效、廉價等特征,CRISPR已經成為最為流行的基因編輯技術,被稱為基因編輯"魔剪".本文介紹了兩位諾貝爾化學獎得主的研究成果,概述了CRISPR系統的發(fā)現歷程,以及CRISPR-Cas9的功能和應用. 

【文章來源】：生物化學與生物物理進展. 2020,47(11)北大核心

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【部分圖文】：

CRISPR-Cas領域關鍵研究成果

更多的基因組測序結果和生物信息學分析表明超過90%的古細菌和約50%的細菌中都有CRISPR-Cas系統.典型的CRISPR序列是由一段引導序列（leader）開始，引導序列中含有轉錄CRISPR序列所需的啟動子.在引導序列之后是多個高度重復序列（repeat）和將這些重復序列隔開的長短不一的間隔序列（spacer）（圖2).CRISPR序列中repeat序列具有種屬特異性，而spacer序列與某些病毒或質粒的序列同源[17-18]，表明這些spacer序列可能來自外源入侵的核酸.2 CRISPR是原核生物體內的獲得性免疫系統

Cas9的HNH和Ruv C核酸酶結構域分別負責切割ds DNA的TS鏈和NTS (non-target strand）鏈.突變HNH活性位點，TS鏈切割受到抑制，而NTS鏈的切割因Ruv C的突變而受到抑制.結構生物學的發(fā)現解釋了Cas9兩種核酸酶結構域分別切割ds DNA兩條鏈的分子機制.Cas9由NUC lobe和REC lobe組成二裂片的結構，含多個正電荷氨基酸富集的核酸結合通道.在Cas9-sg RNA-DNA的結構中，可以觀察到sg RNA與DNA形成一個“R-loop”的結構.cr RNA與TS互補配對，形成cr RNA∶TS雜合雙鏈體.結合在REC lobe和NUC lobe形成的中間通道內，HNH結構域在雜合雙鏈中TS上的切割位點附近對其進行切割，而NTS沿著另一條位于NUC lobe的核酸結構通道伸入Ruv C結構域的活性口袋附近被切割（圖3).PAM序列對于Cas9識別和切割靶標DNA至關重要.Charpentier與Doudna驗證ds DNA protospacer附近的序列對DNA結合和切割的影響，發(fā)現protospacer下游5′-NGG-3′PAM序列是Spy Cas9識別DNA的必要條件.當突變PAM序列，Spy Cas9結合ds DNA的親和力大幅度減弱，切割DNA的活性也隨之降低.Cas9的C端含有PI結構域，它特異性讀取位于NTS上的PAM序列，這影響ds DNA的穩(wěn)定性促使其解鏈，并促進向導RNA與互補DNA雜合形成R-loop結構.通過PI結構域氨基酸與PAM位點核苷酸堿基的特異性相互作用，不同的Cas9識別不同類型的PAM序列.CRISPR位點的spacer附近無PAM序列，而外源核酸protospacer附近含PAM特征序列，因此PAM序列的識別是CRISPR-Cas9區(qū)分“自我”和“非我”的關鍵因素.Cas9通過PAM區(qū)分自身與異己ds DNA,cr RNA∶TS互補配對形成R-loop，實現對靶DNA的精準切割，為基因編輯提供可靠的剪刀.基于Cas9的結構，還可對PI結構域與ds DNA結合的氨基酸進行改造，識別不同的PAM序列，擴大基因編輯工具包[30].

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Crystal structure of Cas1 in complex with branched DNA[J]. Jing Yang,Jiazhi Li,Jiuyu Wang,Gang Sheng,Min Wang,Hongtu Zhao,Yanhua Yang,Yanli Wang.  Science China（Life Sciences）. 2020(04)



本文編號：3009684