發(fā)布時間：2017-04-11 20:07

  本文關鍵詞：Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶基因的克隆及協(xié)同表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木糖醇因其甜度高、熱量低且代謝不受胰島素影響等特性而備受關注,在食品、醫(yī)藥和化工等領域得到廣泛應用,在國際市場上供不應求。近年來,隨著綠色發(fā)展和可持續(xù)發(fā)展理念越來越深入人心,人們的環(huán)保意識增強,生物法生產(chǎn)木糖醇逐漸成為各國學者開展研究的重點。D-阿拉伯糖醇脫氫酶(D-arabitol dehydrogenase,ArDH)和木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)作為木糖醇生物合成途徑中的關鍵酶和限速酶,它們的高效表達對D-阿拉伯糖醇轉化生產(chǎn)木糖醇起著至關重要的作用。因此,構建高性能的基因工程菌,對于木糖醇生產(chǎn)效率的提高以及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。本論文利用PCR技術從泰國葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter thailandicus)中擴增出ArDH的編碼基因ardh,構建重組質粒pET28a-ardh,并在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到了高效表達;ardh的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示有27kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn),純化蛋白并測定其酶學性質。當以D-木酮糖為底物時,還原反應的最適溫度為30℃,最適pH約為5.0,還原反應的比活為11.46U/mg,對D-木酮糖的Km值為27mmol/L,Vmax為22.3μmol/min/mg;當以D-阿拉伯糖醇為底物時,氧化反應最適溫度為30℃,最適pH約為9.0,氧化反應的比活為27.72U/mg,對D-阿拉伯糖醇的Km值為12.5mmol/L,Vmax為52.8μmol/min/mg。同時,克隆并表達了來自G.thailandicus的XDH的編碼基因xdh,構建重組質粒pET28a-xdh,并在大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中得到了高效表達。SDS-PAGE分析結果顯示重組菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過金屬鎳親和層析及Sephacryl S-300凝膠層析純化后,系統(tǒng)地測定其酶學性質。當以D-木酮糖為底物時,還原反應的最適溫度為30℃,最適pH約為5.0,還原反應的比活為126.3U/mg,對D-木酮糖的Km值為11.2mmol/L,Vmax為134.2μmol/min/mg;當以木糖醇為底物時,氧化反應最適溫度為35℃,最適pH約為11.0,氧化反應的比活為28.6U/mg,對木糖醇的Km值為78.6mmol/L,Vmax為53.6μmol/min/mg。利用重組質粒pET28a-xdh和pET28a-ardh構建重組質粒pET28a-xdh-ardh,并轉入E.coli BL21(DE3),實現(xiàn)了xdh和ardh基因的協(xié)同表達。對重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G.thailandicus分別進行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵結果表明重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇產(chǎn)量為23.7 g/L,原始菌G.thailandicus的木糖醇產(chǎn)量為12.9 g/L。重組菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉化率為29.6%,相較于原始菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉化率16.1%有較大提高。
【關鍵詞】：木糖醇 泰國葡萄糖酸桿菌 木糖醇脫氫酶 D-阿拉伯糖醇脫氫酶 協(xié)同表達
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-25
• 1.1 木糖醇的概述12-13
• 1.2 化學加氫合成木糖醇13-14
• 1.3 生物轉化生成木糖醇14-21
• 1.3.1 以木糖為底物產(chǎn)木糖醇14-16
• 1.3.2 以葡萄糖為底物產(chǎn)木糖醇16-21
• 1.4 立題意義21-23
• 1.5 研究內容23-24
• 1.6 技術路線24-25
• 第二章 ardh基因在E.coli中的克隆表達及酶學性質測定25-45
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌株和質粒26
• 2.2.2 主要酶和試劑26
• 2.2.3 培養(yǎng)基26-27
• 2.2.4 主要儀器設備27-28
• 2.3 實驗方法28-37
• 2.3.1 菌體的培養(yǎng)和G. thailandicus總DNA的提取28-29
• 2.3.2 ArDH工程菌的構建29-32
• 2.3.3 ArDH的誘導表達及純化32-34
• 2.3.4 ArDH酶學性質研究34-37
• 2.4 結果與討論37-44
• 2.4.1 重組質粒pET-28a-ardh的構建37-38
• 2.4.2 ardh基因的序列分析38-39
• 2.4.3 重組酶的SDS-PAGE分析、純化及比活力測定39-41
• 2.4.4 ArDH的酶學性質41-44
• 2.6 本章小結44-45
• 第三章 xdh基因在E.coli的克隆表達及酶學性質測定45-59
• 3.1 引言45
• 3.2 材料45-46
• 3.2.1 菌株和質粒45
• 3.2.2 主要酶和試劑45
• 3.2.3 培養(yǎng)基45
• 3.2.4 主要儀器設備45-46
• 3.3 實驗方法46-51
• 3.3.1 菌體的培養(yǎng)和G. thailandicus總DNA的提取46
• 3.3.2 XDH工程菌的構建46-48
• 3.3.3 XDH的誘導表達及純化48
• 3.3.4 XDH酶學性質研究48-51
• 3.4 結果與討論51-58
• 3.4.1 重組質粒pET-28a-xdh的構建51-52
• 3.4.2 xdh基因的序列分析52-53
• 3.4.3 重組酶的SDS-PAGE分析、純化及比活力測定53-55
• 3.4.4 XDH的酶學性質55-58
• 3.6 本章小結58-59
• 第四章 xdh和ardh基因在E.coli中的協(xié)同表達與D-阿拉伯糖醇的轉化59-67
• 4.1 引言59
• 4.2 材料59-60
• 4.2.1 菌株和質粒59
• 4.2.2 主要酶和試劑59
• 4.2.3 培養(yǎng)基59-60
• 4.2.4 主要儀器設備60
• 4.3 實驗方法60-63
• 4.3.1 菌體的培養(yǎng)和質粒的提取60
• 4.3.2 分子克隆操作60-62
• 4.3.3 重組菌的誘導表達62
• 4.3.4 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇62-63
• 4.4 結果分析63-66
• 4.4.1 重組質粒pET28a-xdh-ardh的構建63-64
• 4.4.2 xdh和ardh基因協(xié)同表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析64-65
• 4.4.3 搖瓶發(fā)酵65-66
• 4.5 本章小結66-67
• 第五章 全文總結與展望67-70
• 5.1 主要結論67-68
• 5.2 展望68-70
• 參考文獻70-77
• 致謝77-78
• 在學期間發(fā)表的學術論文及其他科研成果78

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1 林燕清;謝志鵬;張建國;鮑文娜;潘海峰;李博義;;葡萄糖酸氧化桿菌木糖醇脫氫酶基因的克隆與表達(英文)[J];微生物學報;2012年06期

2 沈曉波;齊向輝;朱宏陽;徐虹;;Gluconobacter oxydans木糖醇脫氫酶基因的克隆表達及木糖醇的轉化分析[J];中國生物工程雜志;2009年12期

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7 楊_

本文編號：299858