水稻是世界上最重要的糧食作物之一,雜交稻的培育是提高水稻產(chǎn)量的重要方法,現(xiàn)如今最有效的方法是選育兩用核不育系來配組雜交稻組合,但由于兩用核不育系的選用受到多方面的限制,至今為止還沒有一條特別有效的選育路徑。CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術是繼鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉錄因子效應物核酸酶（TALENs）和巨核酶技術的另一種基因編輯技術,它具有打靶效率高、周期短、載體結構簡單等特點,為定向改良目標基因提供了一條非常有效的基因突變技術手段。隨著水稻功能基因組研究的可喜進展,克隆了一批控制光溫敏核不育性狀的基因,為開展基因定向突變打好了非常好的基礎。本研究選擇水稻隱性光溫敏不育基因PTGMS2-1利用CRISPR/Cas9技術進行定向突變來獲得水稻光溫敏核不育系,開展了如下研究并獲得如下結果:1、構建了CRISPR/Cas9定向突變載體:通過分析PTGMS2-1基因序列,在外顯子上選出以A開頭NGG結尾和G開頭NGG結尾的20個堿基的目標序列,其中以A開頭的目標序列與含有U3啟動子的雙元載體相連,以G開頭的目標序列與含有U6啟動子的雙元載體相連。利用大腸桿菌的轉化方法篩選出目標載體,... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學江西省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 光溫敏不育系的研究進展
        1.1 光照和溫度對兩用核不育系育性的影響
        1.2 光溫敏核不育系的分類
        1.3 兩用核不育系選育的途徑與方法
        1.4 兩用核不育系基因的定位與克隆
        1.5 兩用核不育系選育存在的問題
    2 CRISPR/Cas9介導基因組編輯技術的研究進展
        2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結構
        2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御機制
        2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與類型
        2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯
        2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的研究進展
        2.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展
    3 本研究的目的和意義
第二章 實驗材料與方法
    1 實驗材料
    2 主要的試劑及引物
        2.1 主要的試劑
        2.2 主要的引物序列
    3 載體的構建
        3.1 目標序列的設計
        3.2 連接反應
        3.3 大腸桿菌轉化
        3.4 單克隆菌種的挑取與保存
        3.5 質粒的提取及檢測
        3.6 酶切反應體系
        3.7 農(nóng)桿菌轉化
    4 CRISPR/Cas9的載體遺傳轉化
        4.1 粵泰B愈傷組織的誘導
        4.2 共培養(yǎng)菌液的制備
        4.3 共培養(yǎng)和共培養(yǎng)后愈傷的篩選
        4.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)
    5 轉基因植株的檢測
        5.1 轉基因植株的PCR檢測
        5.2 HMR檢測方法
第三章 結果與分析
    1 載體的構建
        1.1 目標序列的設計
        1.2 大腸桿菌的轉化與質粒的測序
        1.3 載體完整性的驗證
    2 轉基因植株的植物組織培養(yǎng)
    3 轉基因植株的檢測
        3.1 PCR檢測轉基因植株
0代植株靶基因敲除位點初步檢測">        3.2 T₀代植株靶基因敲除位點初步檢測
第四章 結論與討論
    1 討論
        1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對PTGMS2-1 基因定向突變的效果
        1.2 傳統(tǒng)的兩系不育系的育種方式與CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導基因突變的育種方式的優(yōu)劣
        1.3 下一步研究計劃
    2 結論
參考文獻
致謝
附錄 主要試劑配方


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]水稻兩用核不育系的育性光溫效應及遺傳機理[J]. 劉海,陳立云.  作物研究. 2008(S1)
[4]水稻兩用核不育系研究進展[J]. 楊燁,陳立云.  作物研究. 2008(S1)
[5]水稻兩用核不育系C815S的選育與利用[J]. 唐文邦,陳立云,肖應輝,劉國華,鄧化冰.  湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2007(S1)
[6]應用花培技術選育優(yōu)質低溫敏水稻核不育系金山S-1[J]. 陳志偉,林荔輝,周元昌,潘潤森,毛大梅,吳建梅,官華忠.  江西農(nóng)業(yè)大學學報. 2005(05)
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[8]兩用核不育水稻的選育與利用研究進展[J]. 廖亦龍,王豐,李傳國,李曙光,柳武革,劉振榮,黃德娟.  作物研究. 2002(S1)
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[10]實用早秈型兩用核不育系選育策略與進展[J]. 楊遠柱,唐平徠,符辰建,嚴革連.  作物研究. 2002(02)



本文編號：2927206