嗜酸乳桿菌是乳酸菌中重要成員之一,在粘附宿主腸道細胞、與致病菌競爭粘附位點、調節(jié)機體免疫功能上發(fā)揮著重要作用。作為粘附因子的S-層蛋白,受到越來越多學者的關注與研究。隨著基因工程技術的飛速發(fā)展,研究者從S-層蛋白的蛋白分子層面深入研究到了基因分子層面。研究表明嗜酸乳桿菌還有另外一個S-層蛋白基因slpB,與slpA基因不同的地方slpB屬于沉默基因,對于基因slpB研究報道很少,對于其是否具有粘附功能還需要進一步探索。本課題的主要研究方法與結果如下:1、以提取的嗜酸乳桿菌全基因組為模板成功克隆出slpB基因,條帶大小接近1300 bp,與NCBI報道L.acidophilus NCFM基因庫中slpB基因大小一致。構建了重組質粒pET-28a-slpB,經(jīng)過雙酶切驗證,得到約1300 bp的目的片段和約5400 bp的載體片段,與預測值相符。測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果正確。2、對構建的重組質粒pET-28a-slpB進行了表達,確定了目的蛋白上清表達高于沉淀表達。通過控制變量法得到了最佳的誘導表達條件:誘導溫度37℃、IPTG終濃度1mM、誘導時間14h。通過目的蛋白上的His-... 

【文章來源】：南京師范大學江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）質粒構型圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃ?

２．３實驗結果與分析??２３．１辦５基因的克隆??將提取的嗜酸乳桿菌全基因組進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，見左圖２．２Ａ。如圖所??示，提取的ＤＮＡ條帶單一，說明提取出的基因組片段較完整，無明顯降解片段，可??進行后續(xù)基因擴增實驗。??以提取的嗜酸乳桿菌ＮＣＦＭ全基因組為模板，Ｐｌ、Ｐ２為引物特異性擴增功？５基??因，如圖２．２Ｂ所示，條帶大小接近１３００?ｂｐ，與ＮＣＢＩ報道Ｌ?ｃｒｄｔ／ｏｐＭｗｓ?ＮＣＦＭ基因??庫中基因大小一致。??１?Ｍ?Ｍｌ??Ｉ??１９３２９ｂｐ?ｉ????６２２３?ｂｐ??｜｜ＢＳ｜?１５００?ｂｐ????ｌｏｏｏ?ｔ＞ｐ?——??ａ?ｂ??圖２．２全基因組ＤＮＡ與ＰＣＲ擴增結果??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｏｔａｌ?ＤＮＡ?ｏｆ?ＮＣＦＭ?ａｎｄ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ??１９??

Ｍ：空載?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）；?１：重組質粒?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ??連接好的重組質粒經(jīng)過轉化、涂布、培養(yǎng)、藍白斑篩選、菌落ＰＣＲ鑒定，最后??提取質粒如圖２．４所示，重組質粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ條帶明顯高于空載??ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ；），可初步判定有基因片段己連接到Ｔ載體上，是否是目的片段還需??要相應的限制性內切酶進行酶切驗證。??２．３．３重組質粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ雙酶切驗證??重組質粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ經(jīng)Ｎｄｅｌ與Ｘｈｏｌ雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢??測，如圖２．５所示，重組質粒雙酶切后得到大小約為１３００?ｂｐ的片段，與理論值相符，??說明重組質粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ構建成功。將小量酶切驗證有目的基因條帶的重??組質粒樣品送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結果與ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫進行比??對，如圖２．６所示：擴增的１２９９?ｂｐ與數(shù)據(jù)庫信息完全一致。將比對完全正確的重組??質粒進行保存。??１?Ｍ??Ｉ一?２０００?ｂｐ??＇—?１０００?ｂｐ??Ｉ??圖２．５重組質粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ＞ｓｌｐＢ酶切驗證??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ?ｂｙ?ｒｅ


本文編號：2909806