目的:研究下調(diào)圍脂滴蛋白基因(PLIN1)表達對3T3-L1細胞脂解的影響。方法:采用RNA干擾技術,構建3組陽性及1組陰性sh-PLIN1重組載體,并進行菌液PCR和DNA測序鑒定。Western blot測定PLIN1A蛋白表達,評價載體下調(diào)效果。細胞轉染有效載體2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶學方法測定細胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot檢測甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表達。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞中環(huán)磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的濃度。結果:各sh-PLIN1干擾載體構建成功,且3組陽性載體均能顯著下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(P0.05)。轉染有效載體后,與陰性轉染組相比,sh-PLIN1轉染組細胞中脂滴減小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相對表達量顯著升高(P0.05),p-HSL相對表達量及c AMP、PKA的濃度無顯著性差異(P0.05)。結論:下調(diào)PLIN1基因表達可加快3T3-L1細胞脂解速率,其可能通過上調(diào)ATGL和HSL的表達而實現(xiàn),c AMP/PKA信號通路對其無明顯調(diào)節(jié)作用。
【部分圖文】：

2016，36(3)趙志武等:下調(diào)Perilipin1基因表達對3T3-L1細胞脂解的影響量分光光度計測定，其A260/A280值均介于1．8左右，符合純度要求;4組的質(zhì)粒濃度分別為(171．7±9．5)ng/μl、(184．2±9．5)ng/μl、(138．0±8．2)ng/μl和(241．1±10．7)ng/μl。質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，4組目的條帶均約為6400bp，與預測結果一致，說明質(zhì)粒提取準確(圖1)。另外，DNA測序鑒定結果與4組設計的序列完全一致，進一步證實各sh-PLIN1重組載體構建成功。圖1sh-PLIN1重組載體鑒定Fig．1Identificationofsh-PLIN1vector(a)BacteriumliquidPCＲreactionofsh-PLIN1recombinantvectors1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:ddH2Ogroup;6:Emptyvectorgroup;M:DNAmaker(b)Gelelectrophoresisofeveryrecombinantplasmid1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group2．2轉染效率及PLIN1A蛋白表達細胞經(jīng)誘導分化6天和轉染2天處理后，sh-PLIN1-1組、sh-PLIN1-2組、sh-PLIN1-3組和sh-PLIN1-4組細胞轉染率分別為(47．2±5．4)%、(43．6±6．3)%、(44．2±5．0)%和(48．5±7．1)%，均適用于PLIN1下調(diào)效果測定。經(jīng)Westernblot檢測，與sh-PLIN1-4組相比，sh-PLIN1-1組、sh-PLIN1-2組和sh-PLIN1-3組PLIN1A蛋白表達量顯著下降(P＜0．05)，而未轉染組無明顯差異(P＞0．05)，表明3組陽性sh-PLIN1重組載體均可有效下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(圖2)。隨后用sh-PLIN1-1陽性載體作為sh-PLIN1轉染組，sh-PLIN1-4陰性載體作為陰性轉染組進行后續(xù)實驗研究。2．3sh-PLIN1載體對脂滴形態(tài)的影響經(jīng)Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3組細胞中脂滴(綠色熒光)均圍繞細

A蛋白表達量顯著下降(P＜0．05)，而未轉染組無明顯差異(P＞0．05)，表明3組陽性sh-PLIN1重組載體均可有效下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(圖2)。隨后用sh-PLIN1-1陽性載體作為sh-PLIN1轉染組，sh-PLIN1-4陰性載體作為陰性轉染組進行后續(xù)實驗研究。2．3sh-PLIN1載體對脂滴形態(tài)的影響經(jīng)Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3組細胞中脂滴(綠色熒光)均圍繞細胞核(藍色熒光)分布，出現(xiàn)典型的“花環(huán)型”結構。與陰性轉染組相比，sh-PLIN1轉染組中直徑大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，說圖23T3-L1細胞中PLIN1A蛋白表達Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1轉染組中脂滴減校另外，陰性轉染組與未轉染組中脂滴形態(tài)無明顯差異(圖3、圖4)。圖3脂滴熒光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1載體對細胞內(nèi)甘油三酯和甘油含量的影響與陰性轉染組比較，sh-PLIN1轉染組細胞內(nèi)甘油三酯含量下降，甘油含量升高，兩者差異均有統(tǒng)計學意義19

跣宰?咀橄啾齲?sh-PLIN1轉染組中直徑大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，說圖23T3-L1細胞中PLIN1A蛋白表達Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1轉染組中脂滴減校另外，陰性轉染組與未轉染組中脂滴形態(tài)無明顯差異(圖3、圖4)。圖3脂滴熒光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1載體對細胞內(nèi)甘油三酯和甘油含量的影響與陰性轉染組比較，sh-PLIN1轉染組細胞內(nèi)甘油三酯含量下降，甘油含量升高，兩者差異均有統(tǒng)計學意義19
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