背景黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤,早期易發(fā)生淋巴和血道轉(zhuǎn)移,對放化療不敏感,預(yù)后差。近年來,隨著各種致癌基因和腫瘤抑制基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),各種分子生物學(xué)手段也不斷發(fā)展和改進(jìn),基因治療已成為治療腫瘤的熱點(diǎn)。大多數(shù)人類腫瘤中,端粒酶多處于激活狀態(tài),其激活態(tài)與癌細(xì)胞生長關(guān)系密切。轉(zhuǎn)基因端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(TERT)是端粒酶的核心成分,Pin X1(PIN2/TRF1相互作用端粒酶抑制劑1)是一種內(nèi)源性端粒酶抑制劑基因,通過與TERT基因直接結(jié)合,產(chǎn)生抑制端粒酶活性的生物性效應(yīng)。本研究目的:通過分析Pin X1在黑色素瘤組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)情況,探討Pin X1與黑色素瘤不同臨床特征之間的關(guān)系。同時(shí),通過調(diào)節(jié)Pin X1的表達(dá),研究Pin X1對血管生成、黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析208例人黑色素瘤組織微陣列(TMA)中Pin X1的表達(dá)與黑色素瘤組織的病理分級與臨床分期之間的關(guān)系。構(gòu)建Pin X1-si RNA干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染A375和MV3黑色素瘤細(xì)胞,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測其在兩種黑色素瘤細(xì)胞中的干擾效應(yīng)。血管形成實(shí)驗(yàn)觀察沉默Pin X1后的黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的影響。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別觀察沉默Pin Xl基因?qū)谏亓黾?xì)胞增殖能力和細(xì)對黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變,使用Western Blot法測定Pin Xl、MMP-9和TIMP-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果組織芯片(TMA)和免疫組化分析顯示:Pin X1表達(dá)與患者TNM分期有關(guān)。與病理Ⅲ-Ⅳ期組織標(biāo)本相比,Ⅰ和Ⅱ期標(biāo)本中的Pin X1染色顯著降低(P0.01),Pin X1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組Pin X染色顯著降低(P0.01);Western Blot實(shí)驗(yàn)表明:與對照組組相比,轉(zhuǎn)染Pin X1-si RNA的A375和MV3兩種黑色素瘤細(xì)胞中的Pin X1蛋白表達(dá)量明顯下降;血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:以黑色素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),觀察平均管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù);A375和MV3細(xì)胞經(jīng)沉默Pin X1基因處理后,其血管管樣結(jié)構(gòu)形成能力明顯升高。與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:和對照組相比,沉默Pin X1組的兩組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96h位點(diǎn),其增殖效應(yīng)均明顯增強(qiáng),有非常顯著性差異(P0.01)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對照組相比,轉(zhuǎn)染Pin X1-si RNA后,A375和MV3細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E2和MMP-9表達(dá)量顯著上升,同時(shí)p27、p21和TIMP-1表達(dá)量顯著下降,均有非常顯著性差異(P0.01);細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:沉默Pin X1后,兩組細(xì)胞遷移和侵襲能均較對照組明顯增強(qiáng),有非常顯著性差異(P0.01)。結(jié)論P(yáng)in X1表達(dá)在黑色素瘤中明顯下調(diào),其下調(diào)程度與黑色素瘤的臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在黑色素瘤細(xì)胞中低表達(dá)Pin Xl,可通過正性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程來增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力,沉默Pin X1基因還可下調(diào)TIMP-1蛋白導(dǎo)致MMP-9通路激活,進(jìn)而提高黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Pin X1基因可能成為黑色素瘤預(yù)后判斷和靶向治療的新靶點(diǎn),有望在針對黑色素瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的診療中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

PinX1在黑色素瘤組織中的染色（放大倍數(shù)×200）

estern Blot 實(shí)驗(yàn)檢測 PinX1-siRNA 對黑色素瘤細(xì)胞中 PinX1 基因圖 2 B PinX1 蛋白表達(dá)灰度分析圖 （*P < 0.01）PinX1 基因后對血管形成能力的影響在轉(zhuǎn)染 PinX1-siRNA 后細(xì)胞血管形成能力是否增強(qiáng)，胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默 PinX1 基因后

BPinX1蛋白表達(dá)灰度分析圖（*P<0.01）

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本文編號：2824724